Микроманипуляция экспрессии генов в головном мозге взрослых данио рерио Использование церебровентрикулярных Микроинъекции олигонуклеотиды Морфолино
23 мая 2013 г.
В этой статье мы демонстрируем метод манипуляции экспрессии генов в клетках желудочка у взрослых данио конечного мозга с использованием антисмысловых морфолино олигонуклеотидов. Мы представляем этот метод как эффективный и быстрый протокол, который может быть использован для функциональных исследований в головном мозге взрослых позвоночных.
Общая цель данной процедуры заключается в микроинъекции морфолино-олигонуклеотидов в церебральный желудочек мозга взрослой зебрафиш для подавления активности генов в радиальных глиальных клетках. Для этого сначала рыбу подвергают анестезии. Затем с помощью зазубренной стоматологической иглы в черепе, над зрительным бугром, делается разрез.
Затем раствор морфолино через место разреза вводится в жидкость церебральных желудочков. В завершение под флуоресцентным микроскопом проверяют эффективность и точность инъекции. В итоге можно добиться эффективного и широкомасштабного блокирования экспрессии целевых генов в радиальных глиальных клетках мозга взрослой зебрафиш посредством морфолино-опосредованного нокдауна генов, что может быть подтверждено с помощью гистологических срезов и иммуногистохимического окрашивания.
Основное преимущество данного метода перед существующими подходами, такими как трансгенные методы или способы доставки на основе электропорации, заключается в том, что CVMI требует меньше времени и более эффективно воздействует на всю популяцию радиальной глии. Эти параметры регулируемы, и одновременно может быть подавлена экспрессия нескольких генов. Для приготовления инъекционной смеси начните с создания стокового раствора Morpho с концентрацией 500 Micromolar.
Используя PBS для 10 инъекций, приготовьте 10 мкл инъекционной смеси, смешав 9 мкл разведенного или неразведенного раствора морфолино в сочетании с 1 мкл флуоресцентного красителя для отслеживания. Храните смесь при комнатной температуре. Используйте вытягиватель игл для подготовки стеклянных инъекционных капилляров в соответствии со следующими параметрами.
Включите источник давления и установите значение давления на 50 PSI или 3,5 bars. Настройте микроинжектор следующим образом: удерживающее давление (hold pressure) — 20 PSI, давление выброса (eject pressure) — 10 PSI, длительность периода (period value) — 2,5 и 100 миллисекунд.
Диапазон гейтирования. Включите кольцевой осветитель и расположите кольцо над предметным столиком микроскопа. Поместите держатель капилляров в подходящем положении рядом с микроскопом.
Вставьте стеклянный капилляр в держатель и установите угол инъекции на 45 градусов. С помощью тонких концевых пинцетов отломите кончик стеклянного капилляра и откалибруйте выходное давление из отверстия. При погружении кончика иглы в воду с рыбой и подаче непрерывного импульса давления пузырьки воздуха должны образовывать одну линию, что указывает на оптимальное давление или размер отверстия.
Заполните стеклянный капилляр раствором для инъекции. Избегая появления пузырьков воздуха, создайте давление, чтобы удалить воздух между кончиком стеклянного капилляра и введенным раствором для инъекции. После приготовления 0,1% раствора анестетика meba перенесите нужное количество рыб в транспортный контейнер с водой для рыб.
Приготовьте рабочий раствор анестетика, смешав 200 milliliters воды из аквариума с пятью milliliters стокового раствора MISP. Наполните чашку Петри анестетиком наполовину для проведения инъекций. Выдержите рыбу в анестетике до прекращения ее движений.
Затем с помощью сачка перенесите рыбу в чашку Петри с анестетиком. Чтобы облегчить выполнение разреза, аккуратно зафиксируйте рыбу пинцетом, наклонив голову немного вниз. Используя кончик зазубренной иглы 30-го калибра, сделайте небольшой надрез на черепе, не проникая слишком глубоко, чтобы не повредить ткани мозга.
Продолжая удерживать рыбу, введите кончик стеклянного капилляра в место разреза примерно на полмиллиметра и, избегая контакта с тканями мозга, направьте его в сторону цефалона. Введите раствор; он должен распределиться немедленно. Перенесите рыбу в свежую воду и дайте ей восстановиться.
Примерно через 30 минут повторно подвергните рыбу анестезии и осмотрите ее под флуоресцентным микроскопом, чтобы проверить широту распределения жидкости по красной флуоресценции. Верните рыбу в аквариум и поместите ее обратно в систему циркуляции.
До начала поведенческого анализа или подготовки образцов тканей, как показано в данном видео, точная инъекция обеспечивает дисперсию вводимого раствора по всему мозгу и эффективное воздействие на клетки, расположенные близко к поверхности желудочков. Однако при инъекциях, в которых стеклянный капилляр прокалывает ткань мозга, в точке введения будет наблюдаться плотный флуоресцентный сигнал. А если вводимого количества недостаточно, будет наблюдаться слабый флуоресцентный сигнал.
На этом рисунке показано, что морфолино в vivo способны проникать на глубину нескольких клеточных диаметров внутрь желудочковой поверхности и, следовательно, могут эффективно воздействовать на желудочковые клетки по сравнению с контрольным Morpho. Инъекция морфолино против PCNA эффективно подавляет экспрессию гена в желудочковых клетках. На данных изображениях иммунофлуоресценции иммуноокрашивание на BRDU и QCD после эксперимента с импульсным введением A-B-R-D-U демонстрирует, что нокдаун PCNA с помощью антисмысловых морфолино приводит к значительному сокращению числа новообразованных нейронов, что позволяет предположить, что CVMI может быть использован для нокдауна эндогенных генов, что впоследствии приводит к функциональным последствиям.
Таким образом, после своей разработки эта методика открыла исследователям в области нейробиологии путь к изучению молекулярных механизмов, участвующих в регенеративном нейрогенезе мозга взрослого S рыбы.
Обзор
В данной статье представлен метод манипулирования экспрессией генов в вентрикулярных клетках телэнцефалона взрослой зебраданиш с использованием антисмысловых морфолино-олигонуклеотидов. Этот протокол является эффективным и быстрым, что делает его подходящим для функциональных исследований мозга взрослых позвоночных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Экспрессия генов
- Биология развития
Введение
- Методы манипуляции генами имеют решающее значение для понимания функций мозга.
- Антисмысловые морфолиновые олигонуклеотиды позволяют эффективно подавлять экспрессию генов.
- Зебрафиш являются ценной моделью для изучения нейрогенеза позвоночных.
- Существующие методы могут быть трудоемкими и менее эффективными.
Цель исследования
- Разработать быстрый и эффективный метод нокдауна генов у zebrafish.
- Облегчить проведение функциональных исследований ролей генов в мозге взрослых особей.
- Усовершенствовать существующие методы манипулирования генами.
Используемые методы
- Микроинъекция морфолино-олигонуклеотидов в желудочек головного мозга.
- Анестезия zebrafish перед инъекцией.
- Использование флуоресцентного микроскопа для оценки эффективности инъекции.
- Гистологический и иммуногистохимический анализы для оценки эффектов нокдауна гена.
Основные результаты
- Эффективный таргетинг радиальных глиальных клеток в мозге zebrafish.
- Успешный нокдаун экспрессии генов приводит к наблюдаемым функциональным последствиям.
- Метод позволяет осуществлять одновременный таргетинг нескольких генов.
- Результаты демонстрируют потенциал для изучения механизмов нейрогенеза.
Заключение
- Данный метод расширяет возможности изучения функций генов у взрослых особей zebrafish.
- Он представляет собой ценный инструмент для исследований в области нейробиологии.
- В будущих работах этот метод может быть использован для изучения регенерации и нейрогенеза.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Церебровентрикулярная микроинъекция (ЦВМИ) морфолиновых олигонуклеотидов позволяет осуществлять быстрый и широкомасштабный нокдаун генов в радиальных глиальных клетках взрослых зебрафиш, что способствует функциональному изучению механизмов нейрогенеза. Данный подход представляет собой масштабируемый и воспроизводимый метод валидации мишеней в моделях мозга позвоночных, снижая зависимость от трансгенных систем. Эта методика ускоряет проверку гипотез в нейробиологии за счет обеспечения эффективной панвентрикулярной трансдукции с количественно оцениваемыми фенотипическими показателями.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функции генов в клетках-предшественниках желудочков мозга взрослых особей для выяснения их механистической роли в путях нейрогенеза.
- Практическая ценность: облегчает быстрый мультиплексный нокдаун нескольких генов одновременно, повышая производительность при оценке рисков, связанных с мишенями.
- Прогностическая ценность: позволяет выявить функциональные последствия (например, снижение количества новорожденных нейронов), которые связывают модуляцию мишени с фенотипическими результатами, что служит поддержкой для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные инъекционные растворы с флуоресцентными метками для обеспечения стабильности введения и визуализации распределения в желудочках.
- Количественные показатели: обеспечивает возможность гистологической и иммуногистохимической оценки эффективности нокдауна и последующего влияния на маркеры пролиферации клеток.
- Масштабируемость: использование регулируемых параметров давления и калиброванных капилляров гарантирует воспроизводимость объемов инъекций в различных экспериментах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует регуляцию нейрогенеза у взрослых позвоночных, позволяя понять консервативные механизмы, имеющие значение для восстановления ЦНС человека и лечения нейродегенеративных расстройств.
- Трансляционная преемственность: Связывает острый нокдаун генов в клетках-предшественниках с функциональными нейрогенными ответами, что способствует доклинической валидации с использованием соответствующих биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет детально изучить вклад конкретных генов в фенотипы регенерации, уменьшая неопределенность при интерпретации целевых сигнальных путей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод CVMI вписывается в континуум исследований от проверки гипотезы о мишени до функциональной валидации, обеспечивая быструю итерацию между модуляцией генов и фенотипической оценкой на моделях zebrafish.
- Биология открытий: способствует уточнению путей передачи сигналов и валидации мишеней путем нокдауна генов в радиальных глиальных клетках для изучения их влияния на нейрогенез.
- Скрининг: обеспечивает создание готовых к анализу биологических систем с широким распределением по желудочкам для надежной оценки влияния соединений или генетических возмущений.
- Аналитика: позволяет получать количественные гистологические и иммуногистохимические показатели (например, PCNA, BRDU, QC) для измерения эффективности нокдауна и функциональных последствий.
- Трансляционные исследования: связывают модуляцию мишеней в желудочках с нейрогенным выходом, предоставляя релевантную для конкретных заболеваний систему для обеспечения непрерывности доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для быстрого изучения множества генных мишеней, что сокращает затраты времени и средств по сравнению с созданием трансгенных линий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования функции мишени путем установления связи между нокдауном генов в желудочках и измеряемыми нейрогенными фенотипами.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированного приготовления анестетика, калибровки давления и контроля флуоресцентного отслеживания.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски на поздних этапах, обеспечивая раннюю и эффективную проверку мишеней на физиологически релевантной модели мозга взрослого позвоночного.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритезацию мишеней с поправкой на риск на основе функциональных последствий, наблюдаемых в моделях распространенного нокдауна в желудочках.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с zebrafish, проведения микрохирургических операций и методов микроинъекций.
- Зависит от наличия микроинъекторов с регулировкой давления, флуоресцентного микроскопа и инфраструктуры для гистологического окрашивания.
- Необходимо стандартизировать объемы инъекций, использование отслеживающих красителей и протоколы восстановления после инъекций для всех исследовательских групп.
- При применении метода на разных линиях или в разных возрастных группах zebrafish необходимо учитывать вариативность доступа к желудочкам и эффективности диффузии.
- Метод ограничен острым нокдауном генов; он не подходит для исследований хронической или условной модуляции без проведения повторных инъекций.
