Работа с изображениями и 3D Реконструкция Цереброваскулярные структур в эмбриональных данио рерио

Общей целью этой процедуры является оценка цереброваскулярных структур у эмбрионов рыбок данио. Для этого сначала собирают оплодотворенную икру рыб данио и создают условия для обработки. После трехдневного периода роста рыбок данио приносят в жертву неподвижно, и глаз осторожно удаляют, прежде чем установить экземпляр на покровное стекло.

Затем сосудистая сеть головного мозга визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. Наконец, 3D-визуализация сосудистой сети создается с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом. В конечном счете, анализ реконструкций используется для определения влияния условий лечения на разветвление и плотность кровеносных сосудов.

В развивающемся мозге рыбки данио. Эта методика оценивает всю сосудистую систему эмбриона рыбок данио. Это позволило нам изучить биологию бета-амилоида на уровне систем органов.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку препарирование и анализ изображений трудно освоить, потому что они технически сложны. Для начала вырастите трансгенный штамм рыбок данио, экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок в нужных тканях при температуре 28,5 градусов Цельсия с 14-часовым светлым и 10-часовым темным циклом. В этом примере трансгенные рыбы, экспрессирующие EGFP в сосудистых эндотелиальных клетках, выращиваются в ночь перед сбором икры, устанавливают самцов и самок в брачных резервуарах с сетчатым дном.

После использования сетчатого фильтра для сбора яиц и среды Е три для их промывки, используйте Е 3 для переноса яиц в 100-миллиметровые чашки для культуры и инкубации их при температуре 28 градусов Цельсия для изменения цереброваскулярного ветвления. Начиная с 24 часов после оплодотворения, добавьте химическое вещество, такое как ингибитор гамма-секретазы, растворенный в ДМСО. При желании добавьте 0,03% PTU для подавления образования пигмента.

После переноса эмбрионов в раствор в лунки 12, лунки инкубируют при температуре 28,5 градусов Цельсия до тех пор, пока эмбрионы не достигнут желаемой стадии развития. После принесения в жертву эмбрионов в трику и фиксации их альдегидом на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Храните эмбрионы в PBS в темноте при температуре четыре градуса Цельсия.

Чтобы извлечь глаз из эмбриона, используйте заточенную вольфрамовую иглу и разрежьте вокруг ткани, соединяющей один глаз. Затем разрежьте мышцы и, наконец, зрительный нерв, чтобы удалить глаз. После того, как глаз будет удален, переверните эмбрион на покровное стекло пустой глазницей вниз и коснитесь покровного стекла.

Добавьте каплю 3% метилцеллюлозы, чтобы удержать эмбрион на месте и покрыть весь эмбрион, чтобы предотвратить высыхание. Во время визуализации с использованием инвертированного конфокального микроскопа с объективным изображением APO в 20 раз в плане, эмбрион сразу, многие системы визуализации смогут разглядеть сосудистые структуры только на полпути к этому образцу. Если это так, реанимировать, подвесить эмбрион в PBS и снова установить его на контралатеральную сторону для дальнейшей визуализации, провести 3D-реконструкцию цереброваскулярных изображений с использованием изображения J, которое оптимизировано для 3D-визуализации.

Импортируйте конфокальные стеки, перейдя в плагины, локусы, импортер биоформатов, а затем выберите конфокальный файл для стеков Nikon, выберите стек просмотра с гиперстеком и установите цветовой режим на шкалу серого. Затем проверьте автомасштабирование и разделение каналов. Эти варианты откроют четыре отдельные панели каналов.

Закройте все изображения, кроме 16-битного, с именем файла, за которым следует c равно единице. Отрегулируйте порог с помощью вкладки прокрутки внизу, чтобы найти срез с интересующей областью или структурой. Затем перейдите к порогу настройки изображения.

На появившейся панели сдвиньте верхнюю панель влево, чтобы структура была хорошо видна на фоне, и оставьте нижний слайд там, где он есть, чтобы создать новое восьмибитное изображение. Выберите b и w. Затем темный фон.

Не выбирайте порог вычисления для каждого изображения, если для каждого среза не требуются различные корректировки. Далее перейдите к плагинам 3D-просмотрщика порогового значения нуля коэффициента передискретизации один или два и снимите флажки красного и синего цветов, чтобы получить зеленый 3D-выход. В противном случае будет произведен белый рендеринг.

Затем нажмите кнопку Применить. Используйте элементы управления мышью и клавиатурой для поворота, вращения и масштабирования 3D-изображения, чтобы сохранить неподвижные изображения в любой точке. Используйте опцию захвата в меню.

Размер рамки изображения на экране определяет размеры создаваемого изображения в пикселях, поэтому, если требуется изображение с высоким разрешением, увеличьте рамку, перетащив правый нижний угол. Создайте вращающийся 3D-фильм, выбрав «Просмотр записи поворота на 360 градусов». Наконец, сохраните файл в одном из нескольких доступных форматов и используйте бесплатный медиаплеер с открытым исходным кодом VLC для просмотра 3D.

Реконструкция сосудистых структур дает всестороннюю и визуально интересную перспективу развития рыбок данио. Здесь показано несколько углов сосудистых структур у эмбриона данио-рерио через шесть дней после оплодотворения, которые экспрессировали EGFP в эндотелиальных клетках монохромного зеленого или белого цвета. Может быть трудно оценить интенсивность сигнала, но псевдораскрашивание обеспечивает интенсивность изображения из таблицы поиска, что позволяет лучше воспринимать глубину перекрывающихся структур.

Например, на этом рисунке показано псевдоцветное 3D-изображение сосудистой сети у рыбки данио-рерио через шесть дней после оплодотворения после ее развития. Этот метод позволил нам изучить сосудистые эффекты бета-амилоида в мозге позвоночных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать сосудистые сети у эмбриональных рыбок данио, что обеспечивает экономичную и доступную систему для изучения ангиогенеза.