Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы нацелиться на определенный белок в ткани крысы. Это достигается путем первичной изоляции, фиксации и заделки ткани парафином, а затем разрезания ткани и монтажа ее на предметные стекла. Второй шаг заключается в депарафинизации и регидратации залитых парафином участков ткани, а затем блокировании эндогенной пероксидазы.

Затем эпитопы обнаруживаются путем извлечения антигена. Впоследствии проводится блокирование для уменьшения неспецифического связывания перед введением антител. Заключительным этапом является обнаружение специфического эпитопа путем иммуномечения первичными и вторичными антителами, а также выработка сигнала от меченого вторичного антитела.

В конечном счете, сигнал визуализируется с помощью световой микроскопии, чтобы показать картину локализации белка в срезах ткани. Хотя этот метод может дать представление о локализации белка и паттернах экспрессии в центральной нервной системе крыс и в периферических лимфатических узлах, он также может быть применен к другим органам и видам. Для демонстрации процедуры будет выступать техник.

Ее зовут Каталин Бенедек, она работает в центре микробиологии опухолей и клеточной биологии Каролинского института. Чтобы начать подготовку тканей, погрузите рассеченную ткань головного мозга, спинного мозга и периферических лимфатических узлов в четырехпроцентный параформальдегид и поместите его при температуре четыре градуса Цельсия на 24 часа. После того, как ткани будут зафиксированы, перенесите ткань в P-B-S и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшей обработки.

Чтобы начать обработку ткани, с помощью бритвенного лезвия разрежьте ткань на порции размером примерно пять миллиметров. Затем запустите процесс затвердевания тканей с помощью вакуумного инфильтрационного процессора. Стандартная процедура основана на погружении этанола в возрастающие концентрации, за которым следует ксилол и, наконец, парафин.

Далее поместите салфетку в форму. Влейте жидкий парафин вокруг образца, чтобы получился парафиновый блок, и храните его при комнатной температуре. Перед тем, как разрезать ткань, охладите парафиновый блок на ночь на холодной плите или в холодильнике.

После того как парафиновый блок остынет, поместите его в неподвижный держатель микротома санок, который может перемещаться вперед и назад по ножу. Затем отрегулируйте блок и микротомный нож под оптимальным углом, который зависит от геометрии ножа, скорости и техники резки. Вырежьте из парафинового блока три сечения толщиной пять микрон.

Затем перенесите вырезанные секции в контейнер для воды и закрепите секции из воды на коммерческом предметном стекле с предварительно нанесенным покрытием. Затем осторожно прижмите смонтированную секцию к бумажному полотенцу, чтобы удалить остатки воды и возможные пузырьки воздуха. Просушите смонтированные горки в течение пары часов в печке, установленной на 50 – 60 градусов Цельсия.

Как только слайды высохнут, погрузите их два раза в ксилол на 15-20 минут каждый. Затем промойте каждое предметное стекло в 99-процентном этаноле. Чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы, инкубируйте секции в течение 30 минут в растворе метанола, содержащем 0,25% перекиси водорода.

Затем продолжайте регидратацию участков тканей путем промывания растворами этанола, содержащими увеличивающееся содержание воды. Выполните заключительный этап регидратации в дистиллированной воде. Следите за тем, чтобы секции были влажными, пока крышки не будут установлены.

Чтобы извлечь антиген, нагрейте предметные стекла с помощью бытового отпаривателя и буфера ЭДТА при pH 8,5 в течение 60 минут. Затем охладите предметные стекла при комнатной температуре в течение примерно одного часа. Как только предметные стекла остынут, промойте каждое предметное стекло от трех до пяти раз в Трис-буферном физрастворе или T-B-S.

Затем инкубируйте срезы ткани при комнатной температуре в течение 30 минут в блокирующем растворе, содержащем 10 процентов эмбриональной сыворотки теленка и 90 процентов буфера для промывки, чтобы блокировать любые неспецифические фоновые реакции. После того, как участки ткани были заблокированы, разведите необходимое количество первичных антител в блокирующем растворе и инкубируйте предметные стекла в этом растворе первичного антитела в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день промойте предметные стекла три-пять раз буфером T-B-S.

Затем инкубируют предметные стекла со вторичными антителами, разведенными в растворе блокировки в течение одного часа при комнатной температуре. После этого снова промойте предметные стекла три-пять раз буфером T-B-S. Затем инкубируйте предметные стекла с комплексом пероксидазы хрена авидина, разведенным один к 100 в блокирующем растворе, в течение одного часа при комнатной температуре.

После завершения часовой инкубации промойте предметные стекла от трех до пяти раз буфером T-B-S. После приготовления быстрого раствора синей так, как описано в текстовом протоколе, слегка встряхните посуду и процедите полученную смесь. Вылейте раствор на предметные стекла в стеклянной кювете.

Начните инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия и наблюдайте за процессом проявления под световым микроскопом каждые 15-30 минут. После завершения инкубации промойте предметные стекла от трех до пяти раз буфером T-B-S, а затем переложите предметные стекла в буфер P-B-S. Чтобы получить проявляющий раствор перекиси водорода D-A-B, сначала разведите один миллилитр исходного раствора D-A-B в 49 миллилитрах P-B-S.

Добавьте 16,5 микролитров перекиси водорода, а затем процедите раствор. Налейте раствор на предметные стекла и обязательно контролируйте процесс проявки под световым микроскопом, чтобы избежать высокого фона, который может замаскировать конкретный сигнал. Затем промойте предметные стекла от трех до пяти раз с помощью P-B-S, после чего окончательно промойте дистиллированной водой или водопроводной водой.

Монтируйте горки с помощью покровных планок прямо из воды, используя водный монтажный материал. Избегайте образования пузырьков воздуха между крышкой и затвором. После монтажа секций инкубируйте предметные стекла в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы монтажная среда полностью высохла.

Храните высушенные горки при комнатной температуре. Двойное окрашивание участков ткани периферических лимфатических узлов, выделенных у крыс на седьмой день после иммунизации, показало, что cd8-положительные Т-лимфоциты не секретируют хемокин C-C-L 11. В качестве альтернативы, было обнаружено, что C-C-L 11 колокализуется с E-D, маркером лизосомального белка в активированных макрофагах.

I-H-C двойное окрашивание спинного мозга крысы идентифицировало продукцию C-C-L 11 в нейрональных перикариях, дендритах и аксонах, но не в I-B-A одноположительных макрофагах и резидентных в мозге клетках микроглии. Кроме того, было обнаружено, что большинство E-D-1-положительных макрофагов и резидентных в мозге клеток микроглии также не являются C-C-L 11-положительными. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить специфическое и надежное иммуногистохимическое нацеливание белка непосредственно на срезы тканей.