Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель этой процедуры заключается в дифференциации кардиомиоцитов человека от человеческих IPS-клеток, культивируемых в условиях отсутствия фидеров. Это достигается путем предварительного гальванизации IPS-клеток в пластины со сверхнизким уровнем прикрепления для формирования эмбриональных тел. Вторым этапом процедуры является перенос сформированных тел эмбриона в посуду, покрытую желатином.

Когда появляются сужающиеся участки, их вручную препарируют под стереомикроскопом и наносят на посуду, покрытую фибронектином. Для дальнейшей дифференцировки заключительным этапом является получение одиночных кардиомиоцитов путем ферментативного расщепления сокращающихся кластеров. В конечном счете, результаты могут показать дифференцировку кардиомиоцитарных клеток, которые экспрессируют типичные структурные маркеры, т.е. сердечный тропонин с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области сердечно-сосудистой биологии, например, каковы механизмы, управляющие дифференцировкой и дисфункцией сердечно-сосудистой системы во время развития сердечно-сосудистой системы и заболеваний на уровне кардиомиоцитов человека. Это очень интересный метод, потому что он позволяет получать кардиомиоциты in vitro от пациентов и людей. А во втором случае это позволяет рекапитуляцию болезни в пробирке, чтобы можно было экспериментировать с новыми препаратами in vitro, прежде чем перейти in vivo.

Эксперименты: Начните с конфлюентных клеточных культур IPS, выращенных на 35-миллиметровых пластинах, покрытых матригелем. Замените питательную среду одним миллилитром PBS, содержащим миллиграмм дисса. Исследуйте клетки с помощью стеклянных пипеток с опросом.

Удалите участки с дифференцированными клетками, такие как кратероподобные или кистозные структуры в центре колоний. Также удалите все участки, где клетки разделились, сплющились и кажутся мигрирующими наружу. Теперь инкубируйте оставшиеся клетки при температуре 37 градусов Цельсия под культурным колпаком, пока границы колонии не станут ярче и не начнут отделяться.

Обычно это занимает от пяти до семи минут. На этом этапе удалите раствор dispa и промойте клетки одним миллилитром HESM. Затем выбросьте раствор для стирки.

В свежем миллилитре HESM используйте клеточный подъемник для сбора колоний. Соберите колонии в 15-миллилитровую пробирку. Далее промойте клетки еще одним миллилитром ГЭСМ и раскрутите их в 1000 раз G в течение четырех минут.

Затем приступайте к нанесению клеток на матригель и ежедневно меняйте среду во время культивирования. Начните с сбора недифференцированных колоний IPS, как описано в предыдущем разделе. После того, как недифференцированные популяции были изолированы, осторожно суспендируйте их в одном миллилитре EBM 20.

Используя двухмиллилитровую пипетку, не разбивайте клеточные комки слишком сильно. Ограничьте дозирование двумя-тремя ударами. Проверяйте размеры колоний под стереоскопом между ходами.

Когда все колонии имеют примерно одинаковый размер, они не нуждаются в дальнейшем смешивании. Теперь поместите ячейки на пластины со сверхнизким уровнем прикрепления, заполнив одну шестилуночную пластину на пластину собранных клеток. Не забудьте промыть тюбик одним миллилитром EBM 20 и распределить ополаскиватель по тарелке.

После третьего дня инкубации меняйте среды с помощью микроскопа, чтобы избежать удаления тел эмбрионов. Держите пипетку близко к краю пластины. На седьмой день переместите тела эмбриона в пластины, покрытые 0,1%-ным желатином, нагретым до 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Добавьте от 35 до 40 тел эмбрионов в каждую 35-миллиметровую посуду в двух миллилитрах среды. Во время культивирования. Регулярно меняйте среду два раза в неделю.

Проверьте тела эмбрионов на наличие участков бисероплетения и отметьте, где расположены участки бисероплетения. На верхней части крышки посуды полосы сужения бусинами должны появиться примерно через 10 – 20 дней. Когда появляются участки со спонтанным сокращением, переключите их среду на EBM два После появления сокращающихся участков продолжайте культивировать и контролировать другие участки на пластине в течение месяца.

Всего. Дефицит процесса дифференцировки в значительной степени зависит от нескольких факторов, наиболее важными из которых являются специфические клеточные линии и партия сыворотки, используемая для индуцирования кардиодифференцировки. Для получения наивысшей эффективности протестируйте несколько линий на кардиогенный потенциал и различные партии сыворотки Начните с нанесения покрытия 12.

Луночные планшеты с 5 микрограммами на квадратный сантиметр фибронектина в PBS 300 микролитров на лунку должны полностью покрывать поверхность каждой лунки. Дайте планшетам высохнуть в незакрытом кожухе для клеточных культур. Чтобы удалить область бисеринки клеточной культуры, используйте стеклянную пипетку и скальпель.

Затем с помощью пипетки объемом в один миллилитр перенесите четыре-пять зажимов в каждую лунку пластины, покрытой фибронектином. После того, как все сборы будут собраны, добавьте один миллилитр EBM two в загруженные лунки на пластине для сбора отметьте участки, где были удалены клетки. Затем смените среду и верните тарелку в культурный колпак.

Если требуется более мелкие взбивающие комки под стереомикроскопом, пропустите эксплантированные участки через пипетку. В результате образуются небольшие кластеры, содержащие несколько бьющихся клеток. В культуре.

Меняйте среду два раза в неделю, пока они не будут готовы к анализу. Во-первых, приготовьте четыре квадратных квадратных предметных стекла с двумя камерами, покрыв их 20 микрограммами фибронектина, разведенного в количестве, достаточном для покрытия поверхности. Если используется стеклянная подставка, добавьте дополнительно 20 мкг ламинина.

Изолируйте область культивирования бусин, как описано выше. С помощью пипетки объемом в один миллилитр перенесите клетки в пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 500 микролитров пробирки коллагеназы. Инкубируйте клетки в течение 15 минут и встряхните трубку один раз за время инкубации.

Через 15 минут пропустите клетки через пипетку объемом 200 микролитров, чтобы удалить комки, если они остались. Переведите клетки в свежую коллагеназу 2 и повторите инкубацию, когда не останется больших скоплений. Завершите процесс пищеварения, добавив три миллилитра EBM, два без такой соевой кислоты, как каждый из них приготовлен.

Храните пробирки в подогреваемой решетке под колпаком, затем центрифугируйте их при 1000-кратном G в течение четырех минут при комнатной температуре. После центрифугирования сделайте суспензию клеточных фракций из того же исходного образца в миллилитрах 0,25%трипсина ЭДТА в PBS. Затем инкубируйте суспензию в течение пяти минут в нагретом блоке, инактивируйте трипсин четырьмя миллилитрами Е БМ два без как соевой кислоты.

Затем пропустите клетки через иглу 18 калибра на шприце объемом 2,5 миллилитра до семи раз, пока под микроскопом не будут видны большие комки. Затем центрифугируйте клетки при 1000-кратном G в течение четырех минут. Теперь повторно суспендируйте клеточные таблетки в E BM two и наложите их на два предметных стекла камеры скважины.

Клетки будут готовы к анализу через два-три дня инкубации. CMS были сгенерированы из нескольких линий сотовых линий IPS. Эти линии первоначально генерировались на слое питателя метамфетамина и немедленно помещались на матригеле с использованием определенной среды.

Клетки показали человеческую ЭСК-морфологию с фазовыми яркими краями и выступающими ядрами. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что клетки IPS правильно экспрессировали фактор транскрипции T four и экспрессировали поверхностный антиген TRA one 60. Цитофлюорометрический анализ подтвердил экспрессию типичных поверхностных плюрипотентных антигенов, SS EEA 4 и TRA 1 60.

Стратегия стробирования показана в левом скаттере. Также был проведен анализ кариотипа клеток IP FS, выращенных на матричном геле. Индукция в сердечную линию была вызвана агрегацией клеток IPS в EBS, наряду с культивированием в присутствии определенного типа сыворотки.

А в качестве сокращающихся участков сорбиновой кислоты они составляли от 20 до 35% от общего объема культуры в зависимости от используемой клеточной линии. Заразительные ЦМС были выделены из этих областей путем ферментативного расщепления и проанализированы на экспрессию белка. R-T-P-C-R обнаружил экспрессию сердечных специфических ионных каналов, экспрессируемых в бьющихся клетках, полученных из IPS, но не в небьющихся клетках.

Эти каналы включали альфа-канал, субъединицу вольт-зависимого кальциевого канала, альфа-субъединицу натриевого канала пятого типа, потенциал-гейт-канал KQT, подобного подсемейству, и обе формы миозина. Иммунофлуоресцентный анализ тяжелой цепи показал, что кардиомиоциты, полученные из одного IPS, экспрессируют структурные белки, альфа-саркомерный, актин, сердечный тропонин I и сердечный специфический переход, конексион 43. В конце концов, этот метод действительно проложил путь к моделированию заболеваний миокарда in vitro и позволяет экспериментировать с лекарствами в условиях человека без введения препарата в организм человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как поддерживать клетки IPS в свободном состоянии и дифференцировать их в кардиомиоциты с помощью метода, основанного на агрегации тел эмбрионов.