Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данной процедуры заключается в дифференцировке кардиомиоцитов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека, культивируемых в бесфидерных условиях. Это достигается путем первоначального высева ИПСК в планшеты с ультранизкой адгезией для формирования эмбриональных тел. Вторым этапом процедуры является перенос сформированных эмбриональных тел в чашки, покрытые желатином.

При появлении сокращающихся участков их вручную выделяют под стереомикроскопом и переносят на планшеты, покрытые фибронектином. Для дальнейшей дифференцировки на заключительном этапе получают единичные кардиомиоциты путем ферментативного расщепления сокращающихся кластеров. В конечном итоге результаты могут продемонстрировать дифференцировку клеток, подобных кардиомиоцитам, которые экспрессируют типичные структурные маркеры, например, сердечный тропонин, что подтверждается методом иммунофлуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистой биологии, например, о механизмах, определяющих дифференцировку и дисфункцию сердечной ткани в процессе развития сердца и при заболеваниях на уровне кардиомиоцитов человека. Данная методика представляет большой интерес, так как она позволяет получать кардиомиоциты in vitro из клеток пациентов и здоровых людей. Кроме того, она позволяет воспроизвести заболевание в пробирке, что дает возможность тестировать новые лекарственные препараты in vitro перед переходом к исследованиям in vivo.

Эксперименты начинают с конфлюэнтных культур ИПСК, выращенных на 35-миллиметровых планшетах, покрытых матригелем. Замените ростовую среду на 1 мл PBS, содержащего 1 мг diss. Осмотрите клетки с помощью стеклянных пипеток с закругленным концом.

Удалите области с дифференцированными клетками, такие как кратероподобные или кистозные структуры в центре колоний. Также удалите любые участки, где клетки разошлись, уплощились и, по всей видимости, мигрируют к периферии. Теперь инкубируйте оставшиеся клетки при 37 °C в культуральном боксе до тех пор, пока края колоний не станут более светлыми и не начнут отслаиваться.

Обычно это занимает от пяти до семи минут. После этого удалите раствор dispa и промойте клетки 1 мл HESM. Затем слейте промывочный раствор.

В один миллилитр свежей среды HESM с помощью клеточного скребка соберите колонии. Перенесите колонии в пробирку объемом 15 миллилитров. Затем промойте клетки еще одним миллилитром HESM и центрифугируйте их при 1000 ×g в течение четырех минут.

Затем перейдите к высеву клеток на матригель и ежедневно заменяйте среду в процессе культивирования. Начните со сбора недифференцированных колоний ИПСК, как описано в предыдущем разделе. После выделения недифференцированных популяций осторожно ресуспендируйте их в одном миллилитре EBM 20.

Используя пипетку на 2 мл, не разбивайте клеточные агрегаты слишком сильно. Ограничьте количество аспираций двумя или тремя циклами. Между циклами проверяйте размер колоний под стереомикроскопом.

Когда колонии станут примерно одного размера, дополнительное перемешивание не потребуется. Теперь высейте клетки на планшеты с ультранизкой адгезией, заполняя один планшет на 6 лунок на каждую порцию собранных клеток. Не забудьте промыть пробирку 1 mL EBM 20 и добавить раствор для промывки в планшет.

После третьего дня инкубации замените среду, используя микроскоп, чтобы избежать удаления тел эмбрионов. Держите пипетку близко к краю планшета. На седьмой день перенесите тела эмбрионов на планшеты, покрытые 0,1% желатином, который предварительно прогревали при 37 °C в течение 30 минут.

Поместите от 35 до 40 тел эмбрионов в каждую чашку диаметром 35 мм в 2 мл среды. В процессе культивирования регулярно заменяйте среду два раза в неделю.

Осмотрите тела эмбрионов на наличие зон сокращения и отметьте места их расположения. На верхней стороне крышки чашки зоны сокращения должны появиться примерно через 10–20 дней. При появлении зон со спонтанным сокращением замените среду на EBM two. После появления зон сокращения продолжайте культивирование и мониторинг остальных участков на планшете в течение одного месяца.

В общей сложности. В EBM эффективность процесса дифференцировки сильно зависит от нескольких факторов, наиболее критическими из которых являются конкретные клеточные линии и партия сыворотки, используемой для индукции кардиодифференцировки. Для достижения максимальной эффективности протестируйте несколько линий на кардиогенный потенциал и различные партии сыворотки. Начните с покрытия 12.

Планшеты с содержанием фибронектина 5 µg/cm² в PBS в объеме 300 µL на лунку должны быть полностью покрыты по всей поверхности каждой лунки. Дайте планшетам высохнуть без крышек в ламинарном шкафу для культур клеток. Чтобы удалить область с образованием капель в культуре клеток, используйте вытянутую стеклянную пипетку и скальпель.

Затем с помощью одномиллилитрового дозатора перенесите от четырех до пяти кламперов в каждую лунку планшета, покрытого фибронектином. После завершения всего сбора добавьте 1 mL EBM2 в заполненные лунки планшета для сбора и отметьте области, из которых были удалены клетки. Затем замените среду и верните планшет в ламинарный шкаф.

Если под стереомикроскопом требуются более мелкие сокращающиеся кластеры, пропустите эксплантированные участки через пипетку. Это позволит получить небольшие группы, содержащие несколько сокращающихся клеток, в культуре.

Меняйте среду дважды в неделю до начала анализа. Сначала подготовьте двухкамерные предметные стекла размером 4х4 см, покрыв их 20 мкг фибронектина, разведенного в достаточном количестве PBS, чтобы покрыть поверхность. Если используется стеклянная подложка, добавьте дополнительно 20 мкг ламинина.

Изолируйте область с культурой гранул, как описано ранее. С помощью дозатора на 1 мл перенесите клетки в пробирку объемом 15 мл, содержащую 500 µL коллагеназы. Инкубируйте клетки в течение 15 минут, один раз встряхнув пробирку во время инкубации.

Через 15 минут переместите клетки с помощью пипетки на 200 мкл, чтобы удалить оставшиеся агрегаты, если они имеются. Перенесите клетки в свежий коллагеназ два и повторите инкубацию, когда крупные агрегаты исчезнут. Завершите процесс переваривания, добавив три миллилитра EBM два без аскорбиновой кислоты в соответствии с их приготовлением.

Храните пробирки в нагреваемом штативе под вытяжным шкафом, затем центрифугируйте их при 1000 ×g в течение четырех минут при комнатной температуре. После центрифугирования приготовьте суспензию клеточных фракций из одного и того же исходного образца в одном миллилитре 0,25% трипсина-ЭДТА в PBS. Затем инкубируйте суспензию в течение пяти минут в нагревательном блоке и инактивируйте трипсин, добавив четыре миллилитра EBM2 без аскорбиновой кислоты.

Затем пропустите клетки через иглу 18-го калибра на шприце объемом 2,5 миллилитра до семи раз, пока под микроскопом не перестанут быть видны крупные комки. Затем центрифугируйте клетки при 1000 ×g в течение четырех минут. Теперь ресуспендируйте осадок клеток в E BM two и высейте их на двухлунковые камерные стекла.

Клетки будут готовы к анализу после двух-трех дней инкубации. CMS были получены из нескольких линий иПСК. Эти линии изначально были созданы на фидерном слое мезенхимальных клеток и сразу перенесены на Matrigel с использованием определенной среды.

Клетки имели морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека, с фазово-контрастными краями и выраженными ядрами. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что иПСК корректно экспрессируют транскрипционный фактор T4 и поверхностный антиген TRA-1-60. Цитофлуорометрический анализ подтвердил экспрессию типичных поверхностных антигенов плюрипотентности SSEA-4 и TRA-1-60.

Стратегия гейтирования показана на левой диаграмме рассеяния. Также был проведен кариотипический анализ клеток IP FS, выращенных на матрикс-геле. Индукция дифференцировки в кардиальную линию была инициирована путем агрегации IPS-клеток в эмбриоиные тельца (ebs) с последующим культивированием в присутствии сыворотки специфического типа.

Поскольку области сокращения сорбиновой кислоты составляли от 20 до 35% от общей культуры в зависимости от используемой клеточной линии, сокращающиеся CMS были выделены из этих регионов путем ферментативного переваривания и проанализированы на экспрессию белков. Методом R-T-P-C-R была обнаружена экспрессия специфических для сердца ионных каналов в бьющихся клетках, полученных из IPS, но не в небьющихся клетках.

Эти каналы включали альфа-1, субъединицу вольт-зависимого кальциевого канала, альфа-субъединицу вольт-зависимого натриевого канала пятого типа, калиевый вольт-зависимый канал из подсемейства KQT-подобных, а также обе формы миозина. Иммунофлуоресцентный анализ тяжелых цепей показал, что отдельные кардиомиоциты, полученные из иПСК, экспрессировали структурные белки: альфа-саркомерный актин, сердечный тропонин I и сердечно-специфичный соединительный белок коннексин 43. В конечном счете, этот метод открыл путь к моделированию сердечно-сосудистых заболеваний in vitro и позволяет проводить испытания лекарственных препаратов в условиях, имитирующих человеческий организм, без необходимости введения препарата непосредственно в тело человека.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как поддерживать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) в бессывороточных условиях и дифференцировать их в кардиомиоциты методом агрегации в эмбриоподобные тельца.