Caenorhabditis Элеганс Модельной системы для исследования Amylopathy

Общая цель этой процедуры заключается в оценке влияния токсичности бета-амилоида на функцию и выживаемость нейронов. Это достигается путем создания трансгенных червей C-элегантности, экспрессирующих бета-амилоидный пептид с помощью репортера GFP в сенсорных нейронах SE. Затем поведенческие последствия экспрессии бета-амилоида в нейронах SE оцениваются с помощью анализа хемотаксиса.

Третий шаг заключается в получении первичных культур нейронов SE и последующей обработке культивируемых нейронов фармакологическими агентами, такими как Q-V-D-O-P-H для подавления токсического эффекта бета-амилоида. В конечном счете, результаты могут показать влияние токсичности бета-амилоида на функцию и выживание нейронов SE с помощью поведенческих и фармакологических анализов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о нейродегенерации, такие как выяснение конкретных клеточных и молекулярных механизмов.

Основные нейротоксические эффекты бета-амилоидных олигомеров. Демонстрировать процедуры будет доктор Зин Дван, постдок из моей лаборатории Для трансформации требуются инъекционные подушечки для инъекций 2%agros. Нанесите каплю горячего ароса, растворенного в воде, на стеклянную защитную крышку, быстро наденьте на каплю вторую крышку и слегка постучите по ней.

При изготовлении инъекционной смеси обязательно отцентрируйте и переложите верхние пять микролитров, очищенные от мусора и других загрязнений, в свежую пробирку для инъекционной загрузки, инъекционную смесь и пустую плазмиду в инъекционную пипетку капиллярным действием. Половины микролитра обычно достаточно для введения 100 червячков, чтобы расширить отверстие на инъекционной пипетке, потереть ее кончик о край защитного стекла, установленного на стеклянном предметном стекле Масло Halo carbon 700. Качество открытия имеет решающее значение.

О нем судят по форме наконечника и, что наиболее важно, по скорости потока, оценивают по потоку и по размеру пузырьков, образующихся на наконечнике пипетки в ответ на давление впрыска. Теперь нанесите каплю 700 hallow carbon oil на подушечку для инъекций и перенесите на нее несколько червей. Используйте кирку для червей, чтобы опустить червей на подушечку, пока они не прилипнут к подушечке.

Черви должны быть ориентированы рядами так, чтобы их брюшные стороны были выровнены. Избегайте прикосновения к их голове. Если после нескольких попыток черви не прилипают к подушечке, попробуйте использовать новую подушечку или увеличьте толщину или концентрацию подушечки.

Теперь вставьте пипетку в червячок. Во-первых, переместите предметный столик, чтобы расположить червячка под пипеткой, во-вторых. Расположите пипетку рядом с центральным ядром половой железы.

Поскольку его цитоплазма является общей для многих ядер половых клеток, это повышает вероятность передачи введенной ДНК потомству. Пипетка должна лежать практически параллельно червю. В-третьих, двигайте кончиком вертикально по направлению к телу до тех пор, пока кожа не станет вдавленной.

Наконец, осторожно постучите по манипулятору, чтобы вызвать введение кончиков. Теперь введите раствор ДНК. Надавливайте на пипетку до тех пор, пока гонада не набухнет.

Затем остановите поток и снимите червячка с пипетки. Проверьте поток игл, а затем введите другие половые железы, прежде чем переходить к следующему червю. После инъекций добавьте к червям около 10 микролитров восстановительного буфера и подождите, когда они начнут плавать.

После плавания добавьте равный объем буфера M nine. Когда черви возобновят плавание, продолжайте добавлять М девять, пока раствор не станет в основном М девять. Теперь переложите каждого червячка на сидячую пластину.

Соберите червей GR в одном миллилитре буфера M nine в 50-миллилитровой соколиной пробирке. Затем с помощью буфера М девять промойте червей путем повторного центрифугирования и замены раствора до тех пор, пока М девять не станет чистым после промывки. Далее добавьте 10 объемов основного раствора гипохлорита к вшам.

Гранулированные черви инкубируют червей при комнатной температуре до тех пор, пока примерно четыре пятых из них не сломаются, что обычно занимает 10 минут. Следите за реакцией, взяв аликвоты для просмотра в микроскоп. Остановите реакцию, добавив равный объем стерильного яичного буфера.

Затем соберите яйца и тушки центрифугированием при 450 G в течение пяти минут. Аккуратно удалите надосадочную жидкость. Добавьте обратно равный объем яйцевого буфера и снова центрифугируйте пробирку при 450 G в течение пяти минут.

Повторяйте процедуру до тех пор, пока буфер не станет чистым. Теперь инкубируйте яйца в течение ночи в буфере M nine, а на следующий день высадите их на стандартные планшеты NGM. Подготовьте несколько кубиков агара, примерно по полсантиметра со стороной.

Замочите кусочки агара в растворе, содержащем нужный аттрактант, на два часа. Поместите кусок агара в 10-сантиметровую тестовую пластину, на которой отмечено местоположение тестового пятна и контрольного пятна. Подготовьте пять таких тарелок за один опыт.

Дайте пластинам образовать химический градиент, оставив их на ночь при температуре 20 градусов Цельсия на следующий день. Перед экспериментом добавьте по 10 микролитров 20 миллимолярного азида натрия в каждое пятно на пластинах. Это действует как обезболивающее.

Начните эксперимент, поместив 20 возрастных синхронизированных червей в центр пластины, а затем поместите пластину в инкубатор с температурой 20 градусов Цельсия на час. Через час подсчитайте животных на тесте над контрольными точками и рассчитайте индекс ДИ. После лизинга червей и очистки яиц и тушек, как описано ранее, повторно суспендируйте их в двух миллилитрах стерильного буфера для яиц и добавьте два миллилитра стерильной 60% сахарозы в буфер для яиц.

Затем перемешайте трубку вручную или вихревым способом до полного суспензирования яиц. Центрифугируйте ресуспендированные яйца в 450 раз G в течение 15 минут. Затем осторожно соберите надосадочную жидкость, наполненную яйцом, и выбросьте нёбо, чтобы удалить остатки сахарозы, повторно суспендируйте яйца в яйцевом буфере и центрифугируйте их при 450 G в течение пяти минут.

Аккуратно соберите и выбросьте надосадочную жидкость, а затем повторите процесс очистки три раза у вытяжки. Используйте стерильный яичный буфер, содержащий одну единицу на миллилитр хитиназы, для ресуспендирования гранулированных яиц. Дайте яйцам перевариться при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем начните следить за реакцией под микроскопом инвертированной клеточной культуры.

Когда от 70 до 80% яичной скорлупы будет переварено, добавьте пять миллилитров полной питательной среды L 15 или CM 15. Чтобы изолировать клетки, диссоциируйте клетки, чтобы они не образовывали скопления, пропустив их через иглу 27 калибра несколько раз. Теперь пропустите раствор через шприц с фильтром в пять микрон.

Гранулируйте диссоциированную клеточную суспензию центрифугированием при 450 G в течение 15 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированные клетки в СМ 15. Чтобы убедиться в диссоциации клеток, проверьте суспензию под микроскопом.

Наконец, наложите диссоциированные ячейки на стекло, на которое ранее было нанесено покрытие. С помощью лектина арахиса клетки могут поддерживаться при комнатной температуре с обычным воздухом более двух недель. Используя описанные методы трансформации, был сконструирован трансгенный червь для экспрессии человеческого бета-42 в нейронах SE, нейронах, которые обнаруживают водорастворимые аттрактанты, такие как биотин, с помощью анализа хемотаксиса.

Были протестированы трансгенные черви семидневной давности. Контрольная группа без проблем нашла биотин. Напротив, только несколько червей, экспрессирующих бета-42, могут найти место аттрактанта.

Индекс хемотаксиса для биотина составил 0,68 против 0,12 для контрольных и экспериментальных червей соответственно через три-четыре дня. Также произошло небольшое, но заметное падение индекса. Культивируемый нейрон A SER через четыре дня все еще экспрессирует GFP после девяти дней жизни.

Тем не менее, флуоресценция GFP исчезла, и было подозрение, что апоптоз проверяет эту теорию. Первичные нейроны А SER получали в соответствии с описанием и дополняли ингибитором каспазы широкого спектра действия. Как и ожидалось, лечение остановило потерю флуоресценции, подтвердив, что экспрессия A beta 42 человека запускает апоптоз в нейронах A SER.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как конструировать элегантных трансгенных червей, изучать их в поведенческих эссе и как получить первичную культуру от Амброуза.