Восстановление Kv канала в липидные мембраны для Структурно-функциональные исследования

Общая цель данной процедуры — представить детальное описание методов функционального и структурного изучения влияния липидов на мембранные белки. Для этого сначала осуществляют экспрессию и очистку потенциалзависимого калиевого канала. Вторым этапом является реконституция ионного канала.

Затем для функционального изучения ионных каналов проводится электрическая регистрация токов через ионные каналы в липидных бислоях. Заключительным этапом является кристаллизация ионных каналов в мембране для определения их структуры. В итоге для исследования влияния липидов на движение вольтажного сенсора ионных каналов используются биохимические анализы, электрофизиологический метод и электронная кристаллография.

Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями из-за множества технических нюансов при реконституции белков и биофизических записях. Надеемся, что данный фильм и описание процесса помогут вам пройти через всю процедуру и добиться успеха. Демонстрацию всего процесса проведет доктор Хуэй Джим из моей лаборатории.

Перед приготовлением липидов подготовили одноразовую стеклянную пробирку объемом 14 мл, стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой и стеклянный шприц объемом 250 мкл с хлороформом. Затем перенесли 10 мл хлороформа в пробирку. Для приготовления липосом POPE и POPG перенесли 3,75 мг POPE и 1,25 мг POPG в хлороформе в стеклянную пробирку с завинчивающейся крышкой.

Высушите липиды под непрерывным потоком газа аргон, когда видимые следы хлороформа исчезнут. Дополнительно подвергните липиды воздействию вакуума при комнатной температуре в течение одного часа. Затем добавьте 440 µL низкосолевого буфера или воды в пробирку с высушенными липидами и перемешайте на вортексе.

Пробирка для гидратации липидов. Липидная суспензия должна выглядеть белесой и мутной. После этого подвергните липидную суспензию воздействию ультразвука в ледяной бане до тех пор, пока раствор везикул не станет прозрачным.

Затем добавьте в смесь 50 мкл 3 М хлорида калия и 10 мкл 0,5 М DM, чтобы конечная липидная суспензия содержала 300 мМ хлорида калия и 10 мМ DM; инкубируйте раствор в ротаторе в течение двух часов при комнатной температуре для формирования смешанных мицелл липид-детергента. После инкубации суспензия должна стать слегка мутной из-за вызванного детергентом слияния малых везикул ELLA. Если концентрация белка превышает 2 мг/мл, добавьте перечисленные компоненты и смесь липид-детергента, чтобы довести конечный объем до 1 мл.

Затем инкубируйте смесь белка, липидов и детергента в стеклянной пробирке в ротаторе еще в течение двух часов. Приготовление KVAP в смеси с солюбилизированным детергентом DTaP или DOGS аналогично приготовлению липидов для везикул P-O-P-E-P-O-P-G. Однако соникация гидратированных липидов для получения малых одноламеллярных везикул занимает больше времени, чем для липидов P-O-P-E-P-O-P-G; везикулы DOGS могут медленно сливаться друг с другом, образуя небольшие масляные капли для полного солюбилизирования DTaP или DOGS.

Зондированные везикулы смешивают с 10 мМ DM и 40 мМ beta og. Смесь липидов и детергента инкубируют в течение ночи при комнатной температуре; полученная смесь должна быть достаточно прозрачной, без мелких частиц или капель. Затем белок KVAP смешивают с солюбилизированным в детергенте DTaP или DOGS в соотношении белка к липиду, не превышающем 1:10.

Смесь белка, детергента и липидов инкубируют при комнатной температуре в течение двух-трех часов при постоянном орбитальном перемешивании. Для демонстрации медленного удаления детергентов с относительно высокой КМС, таких как DM и Beta og, сначала готовят два литра диализного буфера на каждый миллилитр смеси.

Затем отрежьте подходящий по длине кусок диализного трубочек и промойте его деионизированной водой, чтобы убедиться в отсутствии утечек. Далее перенесите смесь белка, липидов и детергента в диализную трубку. Зажмите оба конца трубки зажимами так, чтобы над раствором осталось минимальное свободное пространство.

Поместите заполненную трубку на магнитную мешалку в диализный буфер таким образом, чтобы трубка медленно вращалась в растворе. Меняйте диализный буфер каждые восемь часов. Теперь подготовьте полистирольные микросферы для удаления детергентов с низкой КМК, предварительно взвесив 0,5 г сухих микросфер.

Затем поместите их в пробирку Corning объемом 50 мл, добавьте 20 мл метанола и обработайте раствор в ультразвуковой бане. Сондируйте в течение пяти минут для удаления пузырьков воздуха, после чего центрифугируйте гранулы при 5 000 об/мин в течение пяти минут. Затем полностью слейте метанол и повторите промывку этанолом и водой Milli Q. Храните промытые гранулы в 20% этаноле при температуре 4 °C, заменив его на буфер без детергентов перед использованием. Оцените количество детергентов в смеси белок-липид-детергент, подлежащей обработке, и рассчитайте количество гранул, необходимое для удаления детергентов.

Взвесьте влажные гранулы без избытка воды и добавьте их непосредственно в белковую смесь; подождите не менее 15–20 минут, чтобы гранулы проявили полную эффективность. Для удаления 8,7 мг DDM из одного миллилитра раствора общая масса полистирольных гранул (например, Bio-Beads SM-2) в размере 87 мг разделяется на пять равных порций. Перемешивайте смесь белка, липидов и детергента с каждой порцией гранул в течение 20–30 минут при постоянном вращении вокруг продольной оси при комнатной температуре.

Центрифугируйте бусины, затем перенесите супернатант в следующую порцию бусин и повторяйте процедуру до конца. На этом этапе начните с очистки стеклянной пробирки, янтарного флакона с винтовой крышкой с тефлоновым покрытием и набора стеклянных шприцев с помощью хлороформа. Затем высушите янтарный флакон в потоке аргона.

Затем перенесите 0,75 milligrams POPE и 0,25 milligrams POPG в хлороформе в янтарную виалу и выпарите хлороформ с помощью потока аргона. После этого добавьте в виалу 0,2 milliliters пентана для растворения высушенных липидов и полностью высушите пробу для удаления остатков хлороформа. Затем добавьте в виалу 50 microliters декана, чтобы растворить высушенный липид.

Теперь нанесите липиды на круглое отверстие в цилиндрической поверхности двухслойного стаканчика, следя за тем, чтобы раствор липидов не попал внутрь отверстия. Подождите одну-две минуты до полного испарения декана, чтобы приступить к электрической регистрации активности каналов KVAP в липидных бислоях. Поместите стаканчик в регистрирующую камеру, установите солевые мостики и подключите электроды к обеим сторонам регистрирующего стаканчика.

Добавьте раствор цист в отверстия электродов, а раствор CYS и транс-раствор — во внешнюю и внутреннюю чашки камеры. Затем отрегулируйте смещение потенциала между двумя сторонами чашки до значения менее 2 мВ, после чего нанесите липид на отверстие в крышке. Подождите, пока мембрана истончится и станет относительно стабильной.

Как только мембрана стабилизируется, внесите от 0,5 до 1 µL канала с везикулами, расположив тонкий конец наконечника дозатора P2 непосредственно над отверстием. Везикулы под действием силы тяжести переместятся через отверстие на дно кюветы.

Для тестирования каналов KVAP в бислое из удерживающего потенциала -80 мВ подается короткий импульс величиной 80 мВ. Из-за быстрой инактивации и медленного восстановления после активации между двумя импульсами выдерживается длительный интервал, составляющий около 120 секунд для каналов в мембранах PEPG. Как только величина тока станет приемлемой, сбалансируйте концентрации ионов в растворах по обе стороны мембраны, добавив дополнительные соли ионов в раствор с низкой концентрацией.

На представленном изображении показан двухмерный кристалл, окрашенный методом негативного контрастирования, на этапе оптимизации кристаллизации. Для окрашивания кристаллов использовали 6% раствор молибдата аммония, pH 6.4, с добавлением 0,5% триозы, так как из-за сахаров кристаллы иногда слипались. Черный квадрат обозначает область, которая дает дифракционную картину с дифракционными рефлексами.

При разрешении около 20 ангстрем представлено изображение крио-ЭМ двумерного кристалла из образца, аналогичного показанному ранее. Образец смешивали с 3% TLOs, замораживали методом прямого погружения и визуализировали с помощью крио-ЭМ при ускоряющем напряжении 50 000 В. Очевидно, что в упаковке кристалла присутствовали локальные дефекты.

Ниже представлено еще одно изображение крио-ЭМ дополнительно оптимизированного кристалла. Образец был погружен в 0,75% танина и 10% tree hellos, изображение было получено при 50 000-кратном увеличении. Прямые линии при плотной упаковке указывают на то, что каналы в кристаллах этого типа были хорошо упорядочены, в то время как две черные стрелки отмечают квадратные векторы.

После просмотра этого видео, я надеюсь, что вы получите четкое представление о том, как правильно работать с липидами и белками, и это видео поможет вам более эффективно изучать взаимодействие липидов и белков в мембране.