Восстановление Kv канала в липидные мембраны для Структурно-функциональные исследования

Общая цель данной процедуры состоит в том, чтобы дать подробное описание методик функционального и структурного исследования влияния липидов на мембранные белки. Это достигается путем первичной экспрессии и очистки потенциал-зависимых калиевых каналов. Вторым этапом является восстановление ионного канала.

Затем выполняется электрическая регистрация ионных каналов в липидных бислоях для исследования функциональности ионного канала. Заключительным этапом является кристаллизация ионных каналов в мембране для определения структуры. В конечном счете, биохимические анализы, электрофизиологический метод и электронно-кристаллографическое исследование используются для изучения влияния липидов на движение датчика напряжения ионных каналов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за множества технических деталей в восстановлении белка и биозаписях. Надеемся, что этот фильм, процесс поможет вам пройти всю процедуру и добиться успеха. Демонстрация всей процедуры будет проведена доктором Хуэй Джимом из моей лаборатории.

До липидного препарата была одноразовая стеклянная пробирка объемом 14 миллилитров, стеклянная пробирка с винтовой оболочкой и стеклянный шприц объемом 250 микролитров с хлороформом. Затем перелейте в пробирку 10 миллилитров хлороформа. Для приготовления липосом POPE и POPG перенесите 3,75 мг POPE и 1,25 мг POPG в хлороформе в стеклянную трубку с завинчивающейся крышкой.

Высушите липиды под непрерывной струей газообразного аргона, когда не останется видимого хлороформа. Попробуйте провести липидное воздействие под комнатным вакуумом в течение одного часа. Далее добавьте в высушенный липидный вихрь 440 микролитров буфера с низким содержанием солей или воды.

Трубка для гидратации липидов. Липидная суспензия должна выглядеть белесой и туридной. После этого ультразвуком обработайте липидную суспензию в ледяной ванне ультразвуком до тех пор, пока пузырьковый раствор не станет полупрозрачным.

Затем при 50 микролитрах трех моляров хлорида калия и 10 микролитрах 0,5 молярного ДМ в смесь так, чтобы конечная липидная суспензия имела 300 миллимолярных хлоридов калия и 10 мкмольярных ДМ, инкубируют раствор во вращателе в течение двух часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить образование липидного детергента смешанных М-клеток. После инкубации суспензия должна стать немного мутной из-за вызванного моющим средством слияния мелких везикул ELLA. Когда белок сконцентрируется более чем до двух миллиграммов на миллилитр, добавьте перечисленные компоненты, липидную моющую смесь, чтобы получилось один миллилитр конечного объема.

Затем инкубируйте белково-липидную моющую смесь в стеклянной пробирке в ротаторе еще два часа. Приготовление КВАП в смеси с моющим средством, растворимым DTaP или DOGS, аналогично липидному препарату для везикул P-O-P-E-P-O-P-G. Тем не менее, ультразвуковая обработка гидратированных липидов в небольшие нели-везикулы занимает больше времени, чем для липидов P-O-P-E-P-O-P-G, везикулы DOGS могут медленно сливаться друг с другом и образовывать мелкие маслянистые капли, чтобы полностью растворить дот или DOGS.

Ультразвуковые везикулы смешивают с 10 миллимолярным DM и 40 миллимолярным бета-og. Липидную моющую смесь инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, при этом смесь должна быть достаточно прозрачной и не содержать мелких частиц или капель. Затем смешайте белок KVAP с растворимым детергентом DTaP или DOGS в соотношении белка к липидам, которое меньше или равно одному к 10.

Белково-детергентно-липидной смеси дают инкубироваться при комнатной температуре в течение двух-трех часов с непрерывным вращением орбиты. Чтобы продемонстрировать медленное удаление моющих средств с относительно высоким уровнем CMC, таких как DM и Beta og. Сначала приготовьте двухлитровый диализный буфер для каждой смеси объемом в один миллилитр.

Затем вырежьте подходящую длину диализной трубки и промойте ее деионизированной водой, чтобы проверить и убедиться, что в трубке нет утечки. Затем загрузите белково-липидную моющую смесь в диализную трубку. Зажмите оба конца трубки так, чтобы над раствором оставалось минимальное пространство.

Поместите загруженную трубку на перемешивающую пластину в диализный буфер так, чтобы трубка медленно вращалась в растворе. Меняйте диализный буфер один раз в восемь часов. Теперь подготовьте полистирольные шарики для удаления моющих средств, которые имеют низкий КМС, по первому крылу 0,5 грамма сухих шариков.

Затем поместите их в 50-миллилитровую пробирку Corning и добавьте 20 миллилитров метанола, обеспечьте раствор ультразвуком в ванне Sonicate в течение пяти минут, чтобы удалить захваченные пузырьки, и проведите на бусинах при 5000 RP в течение пяти минут после этого, полностью сцедите метанол и повторите промывку с этанолом и milli Q водой. Затем храните вымытые шарики в 20% этаноле при температуре четыре градуса Цельсия и замените его на буфер без моющего средства перед использованием. Оцените количество моющих средств в белково-липидной моющей смеси, подлежащей обработке, и рассчитайте количество гранул, необходимых для удаления моющих средств.

Взвесьте влажные бусины без лишней воды и добавьте их непосредственно в белковую смесь и подождите не менее 15-20 минут, чтобы бусины полностью подействовали. Чтобы удалить 8,7 миллиграмм ДДМ в одном миллилитре раствора, в общей сложности 87 миллиграммов полистирольных шариков, таких как биогранулы, SM 2 делят на пять равных частей. Смешайте белково-липидную моющую смесь с каждой фракцией в течение 20-30 минут при постоянном вращении из конца в конец при комнатной температуре.

Закрутите бусины вниз, затем перенесите надосадочную жидкость на следующую фракцию бусин и повторите до конца. На этом этапе начните с очистки стеклянной пробирки и янтарного флакона с помощью завинчивающейся крышки с тефлоновым покрытием и набора стеклянных шприцев с хлороформом. Затем просушите янтарный флакон под струей газообразного аргона.

Затем перенесите 0,75 миллиграмма POPE и 0,25 миллиграмма POPG в хлороформе в угольный флакон и испарите хлороформ с газообразным аргоном. После этого добавьте во флакон 0,2 миллилитра пентана для растворения высушенных липидов и полностью высушите для удаления остатков хлороформа. Далее добавьте во флакон 50 микролитров декана, чтобы растворить высохший липид.

Теперь покрасьте липидами круглое отверстие на цилиндрической поверхности двухслойной чашки, не попадая в отверстие липидным раствором. Подождите одну-две минуты, чтобы декада полностью испарилась для выполнения электрических записей с каналов KVAP в липидном виде послойно. Вставьте чашку в записывающую камеру, вставьте солевые мостики и соедините электроды с двух сторон записывающей чашки.

Добавьте раствор цисты в отверстия для электродов, а раствор CYS и транс — во внешние и внутренние чашки в камере. Затем отрегулируйте смещение потенциала между двумя сторонами чашки до менее чем двух милливольт, а затем нанесите липидную краску на отверстие в колпачке. Подождите, пока мембрана истончится и станет относительно стабильной.

Как только мембрана станет стабильной. Введите от 0,5 до одного микролитра канала, содержащего везикулы, расположив тонкий конец наконечника пипетки P из двух пипеток прямо над отверстием. Пузырьки опускаются поперек отверстия на дно чашки.

Для проверки каналов KVAP в бислое. Короткий импульс в 80 мВ подается от удерживающего потенциала минус 80 мВ за счет быстрой инактивации и медленного восстановления после активации большого интервала, около 120 секунд для каналов в мембранах PEPG дается между двумя импульсами. Как только ток будет выглядеть хорошо по размеру, сбалансируйте концентрацию ионов в растворах по обе стороны мембраны, добавив дополнительные ионные соли на стороне с низкой концентрацией.

Вот изображение отрицательно окрашенного 2D кристалла, середина оптимизации кристалла. Кристаллы были окрашены 6% аммонийного моата, pH 6,4 плюс 0,5% триоза из-за сахара, который они иногда накапливали друг с другом. Черным квадратом здесь обозначена область, которая дает начало дифракционной картине с дифракционными пятнами.

Примерно на 20 ангстрем здесь представлено крио-ЭМ изображение 2D-кристалла из образца, аналогичного показанному ранее. Образец был смешан с 3%-ными TLO и заморожен путем прямого погружения и визуализирован под крио-ЭМ на 50 000 палуб. Понятно, что в кристаллической упаковке имелись локальные дефекты.

Вот еще одно крио-ЭМ изображение дальнейшего оптимизированного кристалла. Образец был погружен в 0,75% танина и 10% дерева, а изображение было получено при 50 000 раз. Прямые линии в плотной упаковке указывали на то, что каналы в этом типе кристаллов были хорошо упорядочены, в то время как две черные стрелки отмечают квадратные векторы.

После просмотра этого видео, я надеюсь, вы получите хорошее представление о том, как правильно обращаться с липидами и белками, и это видео, надеюсь, поможет вам более эффективно изучить действие липидного белка в мембране.