Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения

Общей целью данного эксперимента является создание модельной системы для изучения влияния инфракрасного лазерного излучения на слуховые нейроны in vitro. Это достигается за счет зажима пластыря, культивирования слуховых нейронов во всей конфигурации клетки с целью изучения их электрических характеристик. Впоследствии, воздействие на нейроны лазерного излучения может вызвать электрические реакции в подвергшейся воздействию клетке, которые можно измерить с помощью установки патч-зажима.

Затем можно варьировать параметры освещения и переменные окружающей среды, чтобы наблюдать их влияние на вызванные лазером электрические реакции. Слуховые нейроны, подвергшиеся воздействию лазерного света, будут проявлять воспроизводимую электрическую активность в ответ на каждый лазерный импульс для последующего анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о механизмах, лежащих в основе инфракрасной стимуляции спиральных ганглиозных нейронов.

Хотя этот метод может дать представление об инфракрасной стимуляции спиральных ганглиозных клеток, он также может быть распространен на другие типы клеток или упрощенные модели, такие как липидные бислои, для дальнейшего прояснения физических процессов, которые в этом участвуют. Наглядная демонстрация этого метода важна для обеспечения точного позиционирования по доставке света оптического волокна, поскольку полученное излучение экспозиции является критическим параметром, для чего подготовлены регистрирующие микропипетки с сопротивлением от двух до шести мегаом. Их можно вытащить из силикатного стекла с помощью съемника CO2-лазера.

Подготовьте лазер с волоконной связью. Подойдет широкий спектр оптического волокна. Разрезание волокна в конфигурации патч-корда с разъемами FCPC пополам дает два звена волокна с разъемом на одном конце и открытым волокном на другом.

Это и есть косички. Подготовьте медвежий кончик одной косички, сняв волокнистую оболочку, очистив этанолом и рассекая соответствующим инструментом под микроскопом. Убедитесь, что наконечник перпендикулярен оси волокна и что он выглядит плоским.

При необходимости подключите другой конец оптоволоконной косички к выходу лазера для стимуляции с помощью соответствующего сквозного разъема. На этом этапе всегда обязательно измеряйте выходную мощность лазера от волокна. Делайте это и после любых дальнейших манипуляций с наконечниками.

Теперь вставьте волокно в патрон и зафиксируйте патрон в соответствующем микропозиционере. Далее определите угол, который делает оптическое волокно с покровным скольжением. Сфотографируйте расположение и рассчитайте угол с помощью изображения J.Now, закрепите соединения, которые синхронизируют лазер с патч-зажимом системы сбора данных.

Цифровой выход системы сбора данных патч-клеммы должен быть подключен к лазеру через внешний генератор функций, позволяющий задавать параметры лазерных импульсов независимо от системы сбора данных, сигнал, используемый для запуска лазера, должен быть подключен обратно к входу системы сбора данных, чтобы гарантировать, что время и продолжительность лазерных импульсов могут быть зарегистрированы одновременно с электрофизиологическим сигналом. Установите скорость потока перфузионной системы в диапазоне от одного до двух миллилитров в минуту. Будет работать система с гравитационной подачей со встроенным нагревателем для быстрого нагрева раствора и перистальтическим насосом для удаления отработанного раствора путем всасывания. Колодец. Поместите покровную крышку с культивируемыми клетками в регистрирующую камеру вертикального микроскопа с помощью водно-иммерсионного объектива с большим увеличением и фазового контраста, найдите спиральный ганглиозный нейрон

Типичный спиральный ганглиозный нейрон имеет фазированную яркую круглую форму диаметром около 15 микрон с выступающим ядром. Как только подходящий нейрон будет найден, переключитесь на объектив с меньшим увеличением и найдите целевой нейрон. Затем с помощью микропозиционера перемещайте оптическое волокно до тех пор, пока кончик не окажется близко к целевому нейрону как в горизонтальной, так и в вертикальной плоскостях.

Переключитесь обратно на объектив с большим увеличением и расположите кончик оптического волокна в нужном положении рядом с нейроном. При регулировке вертикального положения волокна важно, чтобы нижний край волокна упирался в покровную кромку. Чтобы свести к минимуму неопределенность в отношении местоположения волокна, точка контакта может быть определена по визуальным сигналам на изображении микроскопа.

Как только волокно будет в нужном положении, переместите его на известную величину вдоль продольной оси, чтобы это не повлияло на положение микропипетки. Микропипетка должна быть заполнена внутриклеточным раствором и надежно установлена на месте на головном столике усилителя. С помощью трубки, прикрепленной к боковой стороне держателя микроэлектродов, приложите небольшое положительное давление, чтобы предотвратить засорение микропипетки.

С помощью микрометрового манипулятора переместите микропипетку в положение чуть выше целевого нейрона и приступайте к изготовлению гигаомной герметизации. Запишите емкость, последовательное сопротивление мембраны и входное сопротивление, определенные по экспоненциальной кривой, подогнанной к току. Во время испытания уплотнения импульсом.

Минимизируйте переходные процессы емкости, регулируя регуляторы CP fast и CP slow на усилителе. Затем переключите усилитель в режим всей ячейки и изменяйте компенсацию емкости и сопротивления до тех пор, пока во время теста SEAL не будет наблюдаться плоский ток. Затем примените последовательную компенсацию сопротивления с коррекцией примерно на 70%, прогнозом на 70%, регулируя элементы управления емкостью и компенсацией сопротивления для поддержания плоской реакции испытательного уплотнения.

Затем переключите усилитель в режим токовых зажимов. Обратите внимание на потенциал мембраны покоя при отсутствии подачи тока. Теперь установите удерживающий ток для стабилизации мембранного потенциала на нужном уровне.

Нейтрализуйте емкость пипетки и отрегулируйте баланс моста, чтобы уравновесить падение напряжения. Проверьте активирующие свойства нейрона, стимулируя его деполяризующим током. На этом этапе переместите оптическое волокно обратно в положение рядом с нейроном с помощью программного обеспечения для визуализации, соединенного с ПЗС-камерой, чтобы получить изображения, первоначально сфокусированные на плоскости нейрона, а затем сфокусированные на верхнем крае оптического волокна.

Проанализируйте изображения, чтобы определить значение дельты, которое представляет собой положение верхнего края оптического волокна относительно центра целевого нейрона. Очень важно точно знать положение оптического волокна. Это связано с тем, что энергия на единицу, площадь или излучение, доставляемое в клетку-мишень, является критическим параметром для инфракрасной нейронной стимуляции, и на это может значительно влиять положение волокна относительно клетки.

Оптическая мощность этого лазера управляется компьютером через прямой вход на лазер и может быть задана вручную перед каждой записью. Длину импульса и частоту повторения можно контролировать с помощью генератора функций, как описано выше, гарантируя, что данные записываются как из канала патч-зажима, так и из лазерного триггерного канала от полутора до 15 миллисекундных лазерных импульсов с частотой от 0,25 до пяти. Миллиджоули обычно дают измеримые электрические отклики. Первоначально.

Может быть полезно установить частоту повторения лазерных импульсов на уровне одного герца или меньше, чтобы свести к минимуму нежелательные эффекты. После того, как все параметры лазера были установлены. Продолжайте сбор данных.

Нейроны спиральных ганглиев реагируют на лазерное излучение с повторяющимися формами волн как в клещи напряжения, так и в токовой клещи Регистрируя конфигурации в ответ на лазерные импульсы продолжительностью 2,5 миллисекунды 0,8 миллиджоуля. Типичная ячейка производит суммарный входящий ток при различных удерживающих потенциалах. Текущие записи клещей показывают устойчивую деполяризацию мембраны в течение этих лазерных импульсов, за которой следует приблизительно экспоненциальное снижение в сторону потенциала мембраны покоя после импульса.

В некоторых случаях также наблюдается небольшая дополнительная деполяризация мембраны после лазерного импульса. Чрезмерное освещение или воздействие большого повышения температуры может привести к повреждению клеток, что приводит к ухудшению электрических свойств клеток или мгновенной гибели клеток. Следуя этой процедуре, можно варьировать ряд параметров окружающей среды, таких как температура раствора или химические факторы, чтобы проверить их влияние на электрическую активность, индуцированную лазером.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть опасной, и необходимо соблюдать стандартные меры предосторожности. К ним относятся использование лазерных защитных очков, предупреждающих знаков и обеспечение того, чтобы луч случайно не пересекался с любыми поверхностями с высокой отражающей способностью.