RNAi-опосредованной Двухместный Нокдаун гена и вкусовые восприятия измерений в медоносных пчел (

В данном видеопротоколе демонстрируются новые методы одновременного нокдауна двух генов у взрослых медоносных пчел с последующим проведением анализа реакции вытягивания хоботка (PER) для измерения эффекта двойного нокдауна генов на вкусовое восприятие медоносных пчел. Это достигается путем предварительного синтеза двухцепочечных РНК, нацеленных на гены трех белков: vitelli, genin, ultras, spherical, а также зеленого флуоресцентного белка.

Поскольку ген, кодирующий GFP, отсутствует в геноме медоносной пчелы, двухцепочечная РНК GFP служит отрицательным контролем. На втором этапе проводят инъекции двухцепочечной РНК в организм пчел, используя четыре стратегии воздействия: инъекция только двухцепочечной РНК GFP; однократная инъекция смеси двухцепочечных РНК VG и USP; инъекция двухцепочечной РНК vg в первый день с последующей инъекцией двухцепочечной РНК USP во второй день; и инъекция двухцепочечной РНК USP в первый день с последующей инъекцией двухцепочечной РНК VG во второй день. После инъекций пчел маркируют цветовыми точками краски, соответствующими вариантам обработки, и возвращают в улей.

Спустя шесть дней нокдаун генов VG и USP у обработанных пчел подтверждают с помощью ПЦР в реальном времени, а влияние двойного нокдауна VG и USP на вкусовое восприятие определяют с помощью анализа PER. В конечном итоге показано, что у пчел с двойным нокдауном наблюдается значительное снижение экспрессии генов VG и USP и значительное повышение вкусовой чувствительности к сахарозе. Наша интерференция является мощным инструментом, который мы можем использовать для раскрытия функций генов.

Обычно этот метод используется для воздействия на один ген. Однако гены являются частью сложных регуляторных сетей. Один из способов лучше понять любой биологический процесс — изучить то, как гены взаимодействуют с генными сетями.

Для этого нам необходимо воздействовать на несколько генов одновременно. До сих пор нам удавалось подавлять экспрессию только одного гена за раз у насекомых; здесь мы впервые хотим показать вам, как осуществить нокдаун сразу двух генов у медоносных пчел вместо одного. Проба на extension reflex (PER) — очень полезный метод измерения вкусового восприятия, которое является поведенческим предиктором социального поведения медоносных пчел.

Например, пчелы-строители с высокой вкусовой чувствительностью быстрее достигают поведенческой зрелости, начинают фуражировку на ранних этапах жизни и предпочитают собирать пыльцу. Для начала данной процедуры сконструируйте праймеры для двухцепочечных РНК, нацеленных на гены для нокдауна, используя бесплатное программное обеспечение primer.Three. В данном эксперименте для нокдауна выбраны два гена: vitelli, genin или VG, и ultras spherical или USP.

В дополнение к дизайну для VG и USP были разработаны праймеры для двухцепочечной РНК, нацеленной на контрольный ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP), который отсутствует в геноме медоносной пчелы. Впоследствии синтез двухцепочечной РНК для VG, USP и GFP осуществлялся путем транскрипции in vitro с использованием системы производства РНК Rib Max T7 от компании Promega.

После очистки двухцепочечных РНК стандартными методами растворите каждый осадок двухцепочечной РНК в воде, свободной от нуклеаз; для обеспечения эффективности подавления экспрессии генов концентрация двухцепочечной РНК должна составлять примерно 9–10 µg/µL. Чтобы подготовить пчел к инъекции, поместите недавно вылетевших пчел в холодильник при температуре 4 °C на одну или две минуты. После иммобилизации пчел закрепите три или четыре особи параллельно на чашках Петри с твердым воском, используя энтомологические булавки, проходящие сквозь область между брюшком и грудью.

Снова охладите пчел в холодильнике при температуре 4 °C в течение примерно одной-двух минут. Убедитесь, что пчелы полностью неподвижны. Тела пчел должны быть расслабленными, без скручиваний или искривлений.

Полная иммобилизация имеет важное значение, так как любое движение может привести к увеличению размера раны и повышению смертности. Пчелы с подогнутым или скрученным телом подвергались охлаждению слишком долго и не должны использоваться из-за высокого уровня смертности. Установите одноразовую иглу 30-го калибра на микрошприц Hamilton.

Наполните шприц 3 µL двухцепочечной РНК, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха в шприце. При использовании стратегии однократной инъекции шприц наполняют смесью двухцепочечных РНК двух генов. При использовании стратегии двухдневных инъекций шприц наполняют одной из двух двухцепочечных РНК.

Введите иглу в боковую часть брюшной полости. Чтобы избежать повреждения внутренних органов, медленно нажимайте на поршень шприца, чтобы двухцепочечная РНК успевала абсорбироваться. Поскольку двухцепочечная РНК обладает высокой вязкостью, для полного вытеснения ее из шприца требуется от двух до трех секунд.

После полного нажатия на plunger оставьте иглу в ране на четыре-пять секунд. Наблюдайте за пчелами в течение трех-пяти секунд после инъекций. Если из раны вытекает капля гемолимфы, удалите пчелу из опыта; пометьте thorax пчел разными цветами, соответствующими различным вариантам обработки.

На этом этапе, если используется стратегия однократной инъекции, наблюдайте за пчелами в течение одного часа в контейнере с предоставленным медом, затем верните их в колонию. Однако, если используется стратегия двухдневной инъекции и была введена только первая порция двухцепочечной РНК, поместите пчел в цилиндрическую сетчатую клетку с медом, закрепленным сбоку. Содержите пчел в инкубаторе при температуре 34 °C и влажности 80% в течение ночи и следующего дня.

Введите тем же пчелам вторую двухцепочечную РНК, используя ту же процедуру, что и для первой двухцепочечной РНК. Дайте пчелам восстановиться при комнатной температуре в течение одного часа в контейнере с медом, а затем поместите их в колонию. Через шесть дней после инъекций соберите обработанных пчел из колонии, не используя дымарь для открытия улья.

Дым не используется, так как он может повлиять на вкусовое восприятие пчел, которое будет оцениваться в данной процедуре. Соберите пчел в клетки-цилиндры из металлической сетки, используя мягкий пинцет, помещая не более трех пчел в каждую клетку для проведения анализа PER.

Охлаждайте пчел при температуре 4 °C до их полной иммобилизации. Закрепите каждую пчелу вертикально в пластиковой трубке, специально предназначенной для PER. Используйте клейкую ленту, чтобы удерживать брюшко внутри трубки, при этом голова должна оставаться снаружи.

Поместите пробирки в штатив с двумя рядами небольших пластиковых колонок. Один ряд пронумерован, чтобы каждой закрепленной пчеле можно было присвоить идентификационный номер. Поместите штативы с обработанными пчелами в инкубатор при температуре 34 °C и влажности 80% на два часа для инкубации пчел.

Приготовьте серию водных растворов сахарозы. Залейте растворы в шприцы с иглами калибра 15–20 для проведения анализа PER.

Пчел тестируют группами. Сначала коснитесь антенны каждой пчелы каплей 0% раствора, который представляет собой воду, после чего проведите тестирование с 0.1%, 0.3%, 1%, 3%, 10% и 30% растворами сахарозы. Между применением каждого водного раствора должно проходить не менее двух минут.

Тестирование 20 пчел с использованием одной концентрации сахарозы обычно занимает около двух минут. Следовательно, в каждой группе всегда должно быть более 20 пчел. Если пчела полностью вытягивает хоботок, это засчитывается как положительная реакция. В режиме реального времени.

ПЦР-анализ подтвердил, что обе стратегии — однократная инъекция и двухдневная инъекция — значительно снизили уровни транскриптов Fiji и USP у медоносных пчел. На этих графиках, построенных через шесть дней после введения двухцепочечной РНК, показатель RQ указывает на уровень относительного количественного определения транскриптов целевого гена, а разные буквы над столбцами обозначают значимые различия между группами обработки. Пост-хок анализ показал, что подавление транскрипта USP при однократной инъекции смеси двухцепочечных РНК и при двухдневной инъекции (сначала VG, затем USP) было значительно ниже, чем при двухдневной инъекции (сначала USP, затем VG).

Это указывает на то, что VG может быть первичным регулятором в регуляторном цикле VG и ювенильного гормона. Показатели GUA в ответ или GRS для обработанных пчел были рассчитаны на основе результатов теста на вытягивание хоботка (PER-тест), как показано здесь. GRS у пчел, которым вводили смесь двухцепочечной РНК VG и USP, была значительно выше, чем GRS у контрольных пчел GFP, что свидетельствует о более высокой чувствительности пчел с двойным нокдауном к сахарозе.

Разные буквы над столбцами обозначают статистически значимые различия между группами обработки. Здесь представлена возможная регуляторная сеть между vitellogenin ultras, spherical и ювенильным гормоном, выявленная путем одновременного подавления генов VG и USP. В то время как одиночный нокдаун USP не вызывает никаких изменений уровня ювенильного гормона, двойной нокдаун VG и USP приводит к более значительному повышению уровня ювенильного гормона, чем одиночный нокдаун VG.

Это позволяет предположить, что vitelli не только подавляет выработку ювенильного гормона, но и ингибирует обратную связь ювенильного гормона на нокдаун USP. При двойном нокдауне резкое увеличение продукции ювенильного гормона является результатом снижения ингибирования со стороны VI генина, вызванного нокдауном VG, и компенсаторного ответа на снижение трансдукции ювенильного гормона, вызванное нокдауном USP. Более детальное обсуждение этой регуляторной сети приведено в сопровождающем тексте протокола.

Используя подход с двойным нокдауном генов, мы выявили детальную взаимосвязь между жизненно важными генами vital, ultras, spherical и ювенильным гормоном, что было бы невозможно при подавлении только одного гена. Теперь, используя данный метод, исследователи могут изучать взаимосвязь между генами в регуляторных сетях. PR является стандартным методом измерения вкусового восприятия. Однако у медоносных пчел этот метод очень чувствителен к внешним воздействиям, поэтому необходимо проявлять крайнюю осторожность для обеспечения единообразия условий окружающей среды и обращения с животными.

Кроме того, если анализ будет проводиться в течение нескольких дней, рекомендуется составить краткий график и следить за тем, чтобы погодные и окружающие условия оставались неизменными.