Подготовка Mgm101 рекомбинации белка на основе МВР тегов стратегии

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке крупных олигомерных ДНК-связывающих белков, таких как MGM 1 0 1, с использованием стратегии мечения мальтозосвязывающим белком (MVP). Это достигается путем первоначального клонирования открытой рамки считывания MGM 1 0 1 ниже MVP в векторе PMLC two E для экспрессии в e coli. Затем гибридный белок M-V-P-M-G-M 1 0 1 очищают из e coli с помощью AMLO-аффинной хроматографии.

Затем MGM 1 0 1 высвобождают из MVP путем протеолитического расщепления и отделяют от MVP с помощью катионообменной хроматографии. На заключительном этапе кольца MGM 1 0 1 очищают до гомогенного состояния методом эксклюзионной хроматографии. В итоге получают примерно 0.8 milligrams растворимого MGM 1 0 1.

Одного литра бактериальной культуры достаточно для биохимической и структурной характеристики этого белка, который играет важную роль в репарации ДНК в митохондриях. Основным преимуществом использования версии MGM 1 0 1 с меткой MBP (maltose binding protein) является то, что эта версия менее токсична, более растворима и более стабильна, чем версия без метки. В результате мы можем получить высокий уровень экспрессии нативного белка MGM 1 0 1 в e coli.

Здравствуйте, меня зовут Сара Вики. Я старший специалист по научно-исследовательской поддержке в лаборатории доктора Джи Тэна здесь, в Медицинском университете SUNY Upstate. Мы с моей коллегой Ван Вонг продемонстрируем экспрессию и очистку MGM 1 0 1. Начните получение слитого белка с амплификации последовательности зрелого MGM 1 0 1 с помощью ПЦР.

Не включайте первые 22 аминотерминальных остатка MGM 1 0 1, которые, как известно, подвергаются отщеплению. После импорта в митохондрии амплифицированный MGM 1 0 1 помещают после последовательности MAL E, которая кодирует мальтозосвязывающий белок или MVP, в модифицированной версии экспрессионного вектора PM MAL C two E. Это приводит к созданию слитого белка M-V-P-M-G-M 1 0 1 с линкером, содержащим сайт расщепления для прецизионной протеазы. Плазмида сначала конструируется путем отбора трансформантов e coli без использования сине-белого скрининга.

Полученную плазмиду pPLC2E, MGM 101, затем вводят в штамм E. coli BL21(DE3)RIL и культивируют на чашках с LB-средой, содержащей ампициллин и хлорамфеникол. Начните с инокуляции 10 мл свежей дополненной LB-среды трансформантами E. coli; инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием при 200 RPM. На следующий день инокулируйте 2 л дополненной LB-среды, используя 10 мл предварительной культуры.

Культивируйте клетки при 37 °C с перемешиванием. Когда значение OD 600 достигнет 0,5, индуцируйте экспрессию слитого белка M-B-P-M-G-M 1 0 1, добавив IPTG до конечной концентрации 0,3 мM; далее культивируйте клетки с перемешиванием при 30 °C в течение пяти часов. По истечении пяти часов перенесите культуры в центрифужные бутыли объемом 500 мл и осадите клетки центрифугированием.

После удаления супернатанта добавьте 30 миллилитров лизирующего буфера с ингибиторами протеаз и ресуспендируйте осадок клеток, несколько раз пропипетировав его. Затем подвергните суспензию клеток ультразвуковой обработке на льду в течение 20 секунд. Используя ультразвуковой процессор с рабочим циклом 50%, дайте клеткам остыть на льду в течение 30 секунд.

Затем повторите этапы соникации и охлаждения еще два раза. Держа суспензию на льду, добавьте 1 mL раствора с концентрацией 2 mg/mL.

Перемешивайте лизат клеток с ДНК-стаком при температуре 4 °C в течение двух часов. По истечении двух часов доведите конечную концентрацию соли до 500 мМ, добавив 4 мл 5 М раствора NaCl к 36 мл лизата.

Затем для удаления клеточного дебриса центрифугируйте пробу при 10,000 ×g при температуре 4 °C в течение 30 минут. Перенесите супернатант в новую пробирку. На этом этапе можно использовать аликвоту объемом 20 µL для контроля эффективности ультразвукового лизиса.

На SDS-ПААГ. Затем клеточный лизат пропускают через амилозную колонку. Для очистки слитого белка MVP MGM 1 0 1 начните с добавления 1,5 миллилитров 50% суспензии смолы AMLO в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем для уравновешивания добавьте 13 миллилитров лизирующего буфера и центрифугируйте при 2000 ×g в течение пяти минут. Повторите эту промывку еще четыре раза, после чего ресуспендируйте смолу в 0,75 миллилитрах лизирующего буфера. Добавьте уравновешенную суспензию AMLO к клеточному лизату и осторожно перемешивайте на качалке при четырех °C в течение ночи.

На следующий день загрузите смесь лизата и амилозного сорбента в колонку для эконом-хроматографии, установленную в холодильной комнате. Откройте кран, чтобы несвязанные белки прошли в пробирку с помощью гравитационной фильтрации. Затем промойте сорбент AMLO, добавив 300 milliliters промывочного буфера один.

После полного прохождения раствора повторите промывку 150 миллилитрами промывочного буфера два. После добавления элюирующего буфера и сбора элюата, как описано в текстовом протоколе, определите выход и чистоту M-V-P-M-G-M 1 0 1, нанеся аликвоту элюата на SDS-PAGE гель.

После проведения электрофореза в геле выполните окрашивание кумаси; должна быть видна одна основная полоса массой приблизительно 70 kilodaltons. Добавьте 50 units прецизионной протеазы к M-V-P-M-G-M 1 0 1 EITs и поместите в диализную трубку с диализным буфером. Оставьте для расщепления на ночь при температуре four degrees Celsius.

Проведите электрофорез в ПААГ-SDS, как описано ранее. Для оценки эффективности расщепления следует учитывать, что при полном расщеплении должны появиться две полосы с молекулярной массой 42 и 28 килодальтон, которые соответствуют MVP и MGM 1 0 1 соответственно. Нанесите расщепленный MVP MGM 1 0 1 путем многократных инъекций на картридж Bio Scale Mini Macro Prep High S, подключенный к системе FPLC Bio-Rad Biologic DUO Flow.

Начните катионообменную хроматографию, применив ступенчатый градиент концентрации хлорида натрия: 5 мM, 300 мM, 500 мM, 750 мM и 1000 мM. Градиент создается путем смешивания буфера A и буфера B. Установите скорость потока 0,5 мл/мин. Собирайте фракции объемом 2 мл с помощью фракционного коллектора; обычно MGM 1 0 1 элюируется при концентрации соли 500 мM.

Объедините фракции пика MGM 1 0 1 и проверьте чистоту белка с помощью SDS-PAGE электрофореза. После объединения белковых фракций, полученных методом катионообменной хроматографии и диализованных в буфере для уравновешивания GF при 4 °C в течение ночи, пик MGM 1 0 1 должен показать одну полосу массой приблизительно 28 kilodaltons. Затем перенесите белок в ультрафильтрационную центрифужную колонку Aveva spin 15 R и центрифугируйте при 3000 ×g при 4 °C для концентрирования белка.

Когда объем уменьшится примерно до одного миллилитра, нанесите MGM 1 0 1 на калиброванную колонку Supra Six prep grade, уравновешенную хроматографическим буфером, и начните эксклюзионную хроматографию с использованием хроматографического буфера при скорости потока 0,5 мл/мин. Крупные олигомерные белки элюируются в ранних фракциях, тогда как малые белки — в поздних. Кольца MGM 1 0 1 элюируются при значении примерно 400 кДа.

Соберите фракции очищенных пиков MGM 1 0 1 с помощью фракционного коллектора, затем нанесите аликвоты этих фракций на 12% SDS-PAGE гель для проверки конечного качества белка. Далее сконцентрируйте белок с помощью Aveva. Центрифугируйте образец при 3000 ×g при температуре 4 °C.

Затем быстро заморозьте аликвоты белка в микроцентрифужных пробирках, погрузив их в жидкий азот на две минуты. Храните образцы при температуре -80 °C в течение от 6 до 12 месяцев. Используйте образцы MGM 1 0 1 для анализа связывания одноцепочечной ДНК и для структурной визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Результаты анализа сдвига электрофоретической подвижности демонстрируют, что очищенный MGM 1 0 1 обладает выраженной связывающей активностью по отношению к одноцепочечной ДНК. Одноцепочечный ДНК-зонд все в большей степени удерживается в лунках нативного полиакриламидного геля олигомерным MGM 1 0 1.

При добавлении M GM 1 0 1 в концентрации более 400 nanomolar. На этих электронных микрофотографиях показана организация структур высшего порядка M GM 1 0 1. Свежеприготовленный M GM 1 0 1 представляет собой отдельные кольца диаметром 20 nanometers, которые можно обнаружить с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием.

После нескольких недель хранения при температуре 4 °C MGM 1 0 1 образует супрамолекулярные спиральные нити. После освоения эта методика может быть выполнена в течение одной недели.

Спасибо за просмотр.