Протоколы для оценки радиочастотных взаимодействий с наночастиц золота и биологических систем для неинвазивной гипертермии лечению рака

Общая цель этой процедуры заключается в оценке нагревательных свойств наночастиц золота в радиочастотном электрическом поле с частотой 13,56 МГц, in vitro и in vivo. Это достигается путем предварительной оценки скорости нагрева концентрированных наночастиц золота и их буфера в кварцевой ветке. Вторым этапом процедуры является проведение in vitro исследований токсичности наночастиц золота с культивируемыми раковыми клетками.

Третий шаг заключается в проведении in vivo исследований наночастиц золота на эктопической модели рака мыши. В конечном счете, результаты могут показать, может ли исследуемая наночастица быть эффективным агентом для использования с радиочастотно-опосредованной гипертермией, путем анализа наночастиц в суспензии, in vitro и in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неинвазивной радиочастотной гипотермии, опосредованной наночастицами, например, является ли нагревание за счет самих частиц и может ли оно быть использовано в терапевтических целях?

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что существует не так много устоявшихся протоколов для проведения такого рода экспериментов. Демонстрировать процедуру будут Сиснерос, научный сотрудник, Стюарт Кор, научный сотрудник, и Лейла Грин, еще один научный сотрудник. В качестве примера начнем с коммерчески доступной 500-миллилитровой бутылки с наночастицами золота диаметром пять нанометров.

Возьмите около 125 миллилитров исходного раствора наночастиц золота и разделите его между шестью центрифужными фильтрующими трубками по 50 килодальтон, центрифугируйте наночастицы со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение двух минут и пяти секунд. Удалите надосадочную жидкость, являющуюся фильтруемым буфером, и залейте каждый фильтр. С большим количеством стокового решения.

Продолжайте центрирование и удаление буфера и повторную загрузку пробирок, пока весь раствор наночастиц не будет отфильтрован. После последнего добавления замените отфильтрованный буфер аналогичным объемом деионизированной воды и повторите процесс еще примерно восемь раз после загрузки отфильтрованного образца буфера в радиочастотную машину. С помощью программного обеспечения инфракрасной камеры создавайте коробки над QVE для захвата профиля нагрева После восьми промывок данные нагрева пятинанометрового фильтрата наночастиц золота приближаются к данным деионизированной воды.

УФ-визуальный анализ также может быть использован для мониторинга поглощения загрязняющих веществ. Пики. Здесь показан чистый спектр. После того, как буферные загрязнители полностью удалены, мы суспендируем наночастицы в 0,5 миллилитрах деионизированной воды в фильтрующих трубках, которые удаляют наночастицы из фильтра.

Затем соедините все шесть суспензий в одну 15-миллилитровую трубку. Теперь проанализируйте образец с помощью УФ-ВИД и дзета-потенциала для получения данных о стабильности. Используйте I-C-P-O-E-S и/или ИСП для определения концентрации наночастиц.

Анализ СЭМ и/или ПЭМ также может быть использован для получения морфологических данных с использованием канзасской радиочастотной системы или производных нагрузки, 1,3-миллилитрового шприца-вета, и установить радиочастотное электрическое поле на уровне около 90 киловольт на метр в воздухе, где будет находиться Q-вете. Для стандартного образца физиологического раствора с 0,9% хлорида натрия электрическое поле будет уменьшено примерно до 1,1 киловольт на метр. Это приблизительные условия, используемые для проведения сравнений между различными радиочастотными системами.

Теперь загрузите чистый кварцевый вет с 1,3 миллилитрами очищенной суспензии наночастиц золота в концентрации 1000 миллиграммов на литр. Поместите образец в радиочастотное поле в течение 120 секунд или до тех пор, пока образец не достигнет 70 градусов Цельсия. Чрезмерное воздействие может привести к образованию электрической дуги или быстрому закипанию.

Захват тепловизионных данных, а также контрольных зон с помощью ИК-камеры и соответствующего программного обеспечения. Повторите эту процедуру три раза на одном и том же образце. Теперь отфильтруйте образец через другой фильтр центрифуги мощностью 50 килодальтон, чтобы извлечь наночастицы золота из буфера воды.

Затем повторно экспонируйте только буфер для радиочастотного поля. Опять же, трехкратная разница в часах между коллоидом наночастиц золота и фильтратом определяет HR из-за самих наночастиц золота. Наконец, мы суспензируем оставшиеся наночастицы золота из фильтра в 1,3 миллилитрах воды для дальнейших экспериментов.

Эти исследования in vitro могут быть применены к любому типу раковых клеток, которые образуют 2D-монослои. В данном примере гепатоцеллюлярная карцинома человека, полученная из гепатоцеллюлярной карциномы, будет использована пластина около 50 000 клеток. В три лунки по 12 лунок пластина с одним миллилитром роста.

Среды продолжают нагружать ячейки до тех пор, пока не будут заполнены три пластины для исследования наночастиц, а три пластины не будут заполнены в качестве контрольных. Инкубируйте пластины при температуре 37,5 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день введите 0,1 миллилитра из 1000 мг на литр раствора наночастиц золота в каждую лунку из трех пластин наночастиц к контрольным пластинам.

По 0,1 миллилитра воды в каждую, хорошо инкубируйте все пластины еще 24 часа. Еще через 24 часа аспирируйте клеточную среду и промойте клетки PBS, чтобы удалить все связанные с поверхностью наночастицы золота. Затем замените питательную среду.

Теперь клетки готовы к радиочастотному излучению. Поместите каждый 12-луночный блок ячеек в радиочастотное поле и подождите, пока ячейки остынут до 31 градуса Цельсия. После небольшого охлаждения подвергните ячейки воздействию радиочастотного излучения в течение 3,5 минут.

Конечная температура среды ячейки составит около 37 градусов по Цельсию. Перенесите клетки в инкубатор и подождите 24 часа, прежде чем анализировать их. Когда клетки будут готовы, аспирируйте среду и замените ее двумя миллилитрами реагента 25%-ного МТТ в среде.

Затем дайте клеткам инкубироваться еще четыре часа. Далее замените носитель МТТ на два миллилитра ДМСО. Поместите клеточные пластины на настольную коромысло на 10 минут, чтобы ДМСО смог растворить реагенты МТТ.

Наконец, пипетка 100 микролитровых образцов из каждой лунки на 96-луночный планшет и оптически считывает показания планшета на 570 нанометров. Эти исследования in vivo могут быть применены к любому типу рака, который образует солидные опухоли в модели ортотопического или эктопического зеркального отражения. В этом примере клетки рака печени Hep-3B используются с голыми мышами BPC.

Начните примерно со 100 000 клеток трипсина, обледените клетки и получите раствор из 2 миллионов клеток на 25 микролитров. Добавьте равное количество ледяного геля матри в клеточную суспензию и тщательно перемешайте путем повторной аспирации в пипетке. Теперь введите смешанную суспензию в нужное положение на спине каждого животного.

Через несколько недель опухоли будут иметь диаметр от половины до одного сантиметра, начнется радиочастотное лечение и будет обезболивать мышей раствором кетамина и ксилазина путем инъекции IP и держать их в тепле. Затем введите наночастицы золота непосредственно в половину опухолей с помощью шприца объемом в один куб. см с иглой 27 или 30 калибра. Используйте хирургический тампон для впитывания крови и протрите место инъекции спиртовой салфеткой.

В качестве контроля вводите только PBS в другую половину опухоли. Теперь обработайте половину мышей в каждой группе. Установите мышь на приемную головку радиочастотного генератора и защитите медной лентой необработанные участки, включая глаза, уши и пальцы ног.

Самая важная часть этого эксперимента — правильное заземление ваших мышей. Без надлежащего заземления накопление заряда на животных может привести к термическим или электрокожным травмам. Это можно легко предотвратить.

Расположите опухоль относительно передающей головки по крайней мере на один сантиметр больше, чем ширина желаемого места лечения. Теперь расположите ИК-тепловизионную камеру так, чтобы была видна опухоль и область лечения. Включите радиочастоту на пять минут и запишите полученную температурную кривую.

Если температура поверхности кожи поднимается выше 42 градусов по Цельсию, следует прекратить лечение сразу после радиочастотного воздействия. Дайте мышам прийти в себя в теплой камере, пока они не придут в сознание. Повторяйте процедуры два раза в неделю в течение трех недель.

Затем усыпьте мышей через 48 часов после окончательного радиочастотного воздействия и обработайте опухоли. Радиочастотный нагрев очищенных наночастиц золота определяли по разнице часов между ними и фоновым буферным раствором деионизированной воды. Результаты оказались такими же, как и ожидалось для частиц размером 5 и 10 нанометров.

Очищенные наночастицы золота, интегрированные в гепатоцеллюлярную карциному человека, получили Hep-три В-клетки. Когда такие клетки подвергаются воздействию радиочастотного поля, они обычно становятся менее жизнеспособными, чем те, которые подвергаются воздействию радиочастот без интернализованных наночастиц. На рисунке 3 показан идеализированный сценарий, в котором используемые наночастицы золота сами по себе имеют ограниченную токсичность, но превосходные цитотоксические свойства, инициированные радиочастотами.

Клетки рака печени Hep 3 B. были использованы для создания опухолей на спинах обнаженных мышей бабси. В эти опухоли вводили взвешенные наночастицы золота PBS с последующим радиочастотным воздействием. Лечение после анализа Томаса показало, что лечение контролирует рост опухоли и уменьшает ее массу.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как оценить наночастицы для использования в радиочастотно-опосредованной гипотермии, определяя их чувствительные к радиочастоте свойства и растворение in vitro и in vivo. Не забывайте, что работа с мощными радиочастотными электрическими полями может быть чрезвычайно опасной. Никогда не прикасайтесь к активному электрическому полю и не дотягивайтесь до него.

Проведите измерения электрического поля и при необходимости используйте надлежащее экранирование, такое как клетка Фарадея. В целом, всегда сводите к минимуму воздействие постоянных электрических полей высокой силы.