Улучшенная Подготовка и консервация срезов гиппокампа мышь для очень стабильный и воспроизводимый Запись Долгосрочные Потенцирования

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы иметь возможность регистрировать очень стабильную и воспроизводимую долгосрочную потенциацию в острых срезах гиппокампа. Это достигается путем предварительного извлечения мозга мыши и препарирования гиппокампа в холодной спинномозговой жидкости под микроскопом. Второй шаг – разрезание поперечных срезов гиппокампа тканевым измельчителем.

Далее срез помещается в камеру записи интерфейса, которая будет перфузирована насыщенной кислородом искусственной спинномозговой жидкостью. Заключительным этапом является размещение электродов и регистрация синаптической активности в КА одной из областей гиппокампа. В конечном счете, протокол высокочастотной стимуляции используется для демонстрации индукции очень стабильной долгосрочной потенциации.

С помощью этого метода можно получить представление о механизме, лежащем в основе синаптической пластичности. Он также может быть применен к другим системам, таким как животные модели нейродегенеративной или нервной системы, или к иммунным заболеваниям. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что все манипуляции требуют большого мастерства и большой практики.

Начните эту процедуру с промывки контура перфузии дистиллированной водой в течение не менее 20 минут. Затем включите системы отопления. Запустите барботирование карбогена в цепи.

Карбоген подается в водяную баню под камерой записи через воздушные диффузоры. Затем отрегулируйте расход в водяной бане с помощью расходомера После этого слейте воду из контура и заполните его отфильтрованным ответвлением A CSF для удаления пузырьков. Затем поместите кольцо, которое будет поддерживать срез, в камеру выдержки.

Аккуратно удалите все пузырьки воздуха из контура. Затем отрегулируйте уровень A CSF в регистрирующей камере с помощью винта всасывающей иглы, скорость входного насоса регулируется с точностью до одного миллилитра в минуту, а выходного насоса — до пяти миллилитров в минуту. Перед вскрытием подготовьте все хирургические инструменты.

Чтобы удалить мозг принесенной в жертву мыши. Придерживайте его голову указательным и большим пальцами, и сделайте надрез ножницами для препарирования вдоль середины макушки головы, начиная от края гильотины, разрежьте и пройдите неваляшкой до лобной кости. Затем разрежьте кожные мышцы с каждой стороны головы, чтобы полностью обнажить пластины черепа.

Затем удалите мышцы со стороны головы. Впоследствии разрежьте височную мышцу с каждой стороны вдоль височной пластины. Затем разрежьте лобовые пластины посередине поперечно.

Теперь сделайте небольшой надрез на затылочной кости между двумя пластинами. Разрежьте у основания затылочных пластин с каждой стороны. Затем пружинными ножницами разрежьте вдоль сагиттального шва.

Наконец, удалите череп, раздвинув половинки друг от друга с помощью щипцов. Теперь с помощью скальпеля разрежьте непосредственно перед мозжечком и сразу после обонятельной луковицы, затем поперечно перенесите извлеченный мозг в чашку для препарирования с холодным А ликвором. После того, как мозг появится в анатомической чашке, отделите два полушария друг от друга с помощью скальпеля, вставленного посередине под бинокулярным хирургическим микроскопом, осторожно раздвиньте структуру одного полушария, чтобы открыть боковой желудочек.

Удалите ствол мозга и головной мозг, положив один шпатель на лобную кору, а другой шпатель на головной мозг. Будьте осторожны, чтобы не задеть шпателем гиппокамп и не растянуть его во время разрезания тканей. После этого разрежьте свод.

Затем аккуратно вытолкните гиппокамп из коры головного мозга, вставив шпатель в желудочек. Когда гиппокамп будет извлечен, удалите излишки корковой ткани и оставшиеся кровеносные сосуды с помощью пластиковой пастбищной пипетки с широким горлышком. Перенесите гиппокамп ложкой его альвийской поверхностью вверх на платформу измельчителя.

Удалите лишнюю жидкость из ложки с помощью стандартной пластиковой пастбищной пипетки. После этого наклоните ложку вертикально вверх, почти касаясь фильтровальной бумаги на измельчителе. Опустите гиппокамп, быстро коснувшись фильтровальной бумаги.

Затем достаньте ложку. Далее ориентируем гиппокамп и разрезаем его. Поперечно до 400 мкм с помощью измельчителя.

Выполняйте процедуру как можно быстрее. Впоследствии снимите фильтровальную бумагу с ломтиками гиппокампа и оберните ее вокруг металлического цилиндра, чтобы немного раздвинуть ломтики. Затем освободите срезы с помощью распылителей ликвора с помощью стандартной пластиковой пасторальной пипетки и соберите их в чашку Петри, наполненную холодом.

Спинномозговая жидкость. Перенесите выбранный срез в камеру записи с помощью стандартной пластиковой пипетки мимо. Дайте срезу восстановиться после травмы рассечения в камере интерфейса записи при температуре 28 градусов Цельсия.

Если срез опускается ниже уровня A CSF до уровня среза, то снова поднимите уровень A CSF, чтобы срез плавал. После этого срез ориентируется в положение, которое облегчит позиционирование электродов в одной области СА. Прекратите понижать уровень A CSF, когда он находится на интерфейсе.

Мениск сред вокруг среза свидетельствует о достаточном уровне А СМЖ. Сетка должна быть пропитана средой, но не полностью погружена в воду. Затем держите камеру накрытой фильтровальной бумагой над перфорированной крышкой.

Дайте ломтику постоять не менее одного часа 30 минут при температуре 28 градусов Цельсия перед записью. Вот эскиз, который показывает два независимых синаптических входа как один и S два в одной и той же нейронной популяции. S-один путь использовался для индуцирования LTP, в то время как S-два пути действовали как контроль.

Это образцы трасс F-E-P-S-P, записанные непосредственно перед индукцией LTP, как показано красными трассами, и через час после индукции LDP, обозначенной синей трассой. Вот F EPSP из совершенно здорового кусочка, а вот F EPSP из кусочка, демонстрируя высокий уровень возбудимости, когда ломтики не совсем здоровы. Наблюдаются полисинаптические реакции, а потенцирование наклона F-E-P-S-P снижается

Ниже приведено сравнение временных ходов наклона F-E-P-S-P после ЛТП, индуцированной одной серией высокочастотной стимуляции, зарегистрированной в 2005, 2010 и 2011 годах в нашей лаборатории. Первые эксперименты были зафиксированы в 2005 году и обозначены закрашенными кругами. Последующие записи, обозначенные закрашенными квадратами, выиграли от улучшенной процедуры вскрытия.

Текущие результаты получены в результате оптимизации оксигенации границы раздела раздела и контроля температуры, а также нормализации электродов, как показано разомкнутыми кругами. Здесь мы показываем, что увеличение скорости потока кислорода в водяной бане под камерой регистрации с 0,15 до 0,25 литров в минуту, как показано синей кривой, приводит к уменьшению наклона F-E-P-S-P на 20%, повышая температуру с 28 до 29 градусов Цельсия. Как показано, зеленая кривая вызывает увеличение наклона F-E-P-S-P более чем на 50%.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что каждый шаг имеет решающее значение, и ошибки в протоколе могут привести к разным результатам. Посмотрев это видео, у вас будет хорошее понимание того, как получить очень стабильную долгосрочную потенцию. Запись в острые срезы гиппокампа.