Прижизненные микроскопия микроциркуляцию в мышцах мыши Кремастер для анализа периферических стволовых клеток миграции

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации взаимодействий эндотелиальных клеток стволовых клеток in vivo. Это достигается путем введения сначала катетера бедренной артерии в животное под действием седативных препаратов для внутриартериального доступа. На втором этапе хроматическая мышца хирургическим путем подготавливается к прижизненной флуоресцентной микроскопии.

Затем представляющая интерес популяция стволовых клеток вводится через катетер бедренной артерии. В конечном счете, взаимодействия между адоптивно перенесенными стволовыми клетками и эндотелием микроциркуляции главной мышцы могут быть визуализированы и количественно оценены. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, например, как регулируется миграция терапевтически применяемых стволовых клеток в живом организме?

Перед началом микрохирургии D воздух катетер подключался к одномиллилитровому шприцу с 0,9% хлорида натрия. Затем аккуратно выбрейте переднюю часть правой мошонки, а также правое бедро и пах самца мыши, находящегося под наркозом весом от 20 до 25 мг. Соберите все распущенные волосы смоченным ватным тампоном, а затем поместите брюшную сторону мыши вверх на изготовленную на заказ смотровую площадку из плексигласа, состоящую из опорной пластины и второй пластины на краю основания для поднятия обеих задних лап и мошонки.

Зафиксировав ноги эластичной простыней, поместите сцену на грелку, чтобы поддерживать температуру тела животного на уровне 37 градусов по Цельсию. Затем, используя 10-16-кратное увеличение, используйте диссекционный микроскоп и ножницы, чтобы сделать первоначальный разрез на правом бедре, прямо перед бедренными сосудами от колена до паха. Определите бедренную артерию и проследите за ней проксимально, мобилизуя артерию из окружающих мягких тканей.

Затем с помощью термоприжигания определить и перерезать большую артериальную ветвь, ведущую к левому яичку. Наложите шов на левое яичко. Затем определите и прижгите большую артериальную ветвь, проходящую медиально у бедра.

Далее, используя щадящее вытяжение, перевязать бедренную артерию в дистальной части правого бедра, а затем наложить шов вокруг проксимальной бедренной артерии как можно ближе к центру животного. Теперь наложите свободный узел вокруг бедренной артерии, но не перевязывайте его. Затем нанесите мягкое вытяжение на шов, чтобы создать артериальный перегиб.

После установления перегиба используйте микроножницы, чтобы тщательно определить размер артерии, уделяя особое внимание тому, чтобы не повредить бедренную вену. Далее в разрез вводят подготовленный ранее микрокатетер. Осторожно ослабляйте перегиб, чтобы облегчить прохождение катетера.

Артериальный кровоток должен быть немедленно виден внутри катетера. Медленно продвигайте катетер на несколько миллиметров за пределы предыдущего изгиба. Затем завяжите подготовленную лигатуру для фиксации катетера.

Теперь аккуратно промойте катетер хлоридом натрия, а затем аспирируйте раствор, чтобы подтвердить правильное положение катетера. С помощью куска ленты дополнительно закрепите катетер на стадии операции. После того, как катетер будет адекватно зафиксирован и отодвинут в сторону, разрежьте кожу и фасцию над вентральной стороной правой мошонки.

Соблюдайте осторожность, чтобы не прикасаться к подлежащим тканям какими-либо инструментами. Разрез распространите вверх до паховой складки и до дистального конца мошонки. Затем аккуратно отделите подлежащие мягкие и соединительные ткани над кремастерным мешком, не касаясь самой ткани.

Затем наложите шов на дистальный конец кремастера, чтобы немного растянуть мышцу. Затем осторожно потяните мышцу вперед и вперед, чтобы подсечь оставшиеся мягкие ткани под мышечным мешком. После полного отделения от соединительной ткани с помощью ножниц откройте С-образный мешок на краю черепа и продлите разрез от этого отверстия вниз до дистального конца мышцы.

После термического прижигания небольшого сосуда, соединяющего яичко на кремастере, с помощью ножниц перережьте оставшиеся соединения между мышцей и яичком. Открытый кремастер теперь будет лежать на сцене. Теперь поместите четыре шовных нити по краям ткани и зафиксируйте их эластичной простыней.

Чтобы распространить мышечную ткань кремастера с этого момента, используйте одномиллилитровый шприц для непрерывного увлажнения ткани PBS. После того, как препарат отдохнет в течение 15 минут, введите от 0,05 до 0,1 миллилитра 1% родина декстрина через левую бедренную артерию для контрастного усиления микрососудистой сети. Теперь переместите мышь и рабочую область под устройство с зарядной связью.

К видеокамере подключается флуоресцентный микроскоп, модифицированный для эпиподсветки, с особой осторожностью не вывихнутый катетер бедренной артерии. После корректировки цели погружения в воду для достаточной визуализации микроциркуляции CHMA стохастически определены шесть посткапиллярных ЭС для последующего анализа твердой адгезии стволовых клеток. Затем загрузите в миллилитровый шприц 200 микролитров ранее помеченных флуоресцентных донорских стволовых клеток костного мозга.

Осторожно постучайте по шприцу в реанимацию, приостановите клеточную суспензию, а затем введите клетки через бедренный катетер в количестве 40 микролитров, в общей сложности пять последовательных инъекций. Запишите перекатывание стволовых клеток сразу после инъекции клеток. Определение перекатывания как более чем на 50% снижение скорости клеток вдоль эндотелиальной выстилки в сочетании с типичными движениями клеточного стика и высвобождения.

После завершения внутривитальной микроскопии аккуратно удалите кремастерную мышцу и сохраните ее для последующего анализа. В целом, взаимодействие непосредственно вводимых стволовых или прогениторных клеток с эндотелием сосудов в рамках микроциркуляции кремастерной мышцы является редким явлением и происходит исключительно в посткапиллярных лесах за счет флуоресцентного мечения. Катящиеся клетки, обозначенные черной стрелкой, и прочно прилегающие стволовые клетки, обозначенные белыми стрелками, можно четко отличить от циркулирующих эндогенных лейкоцитов в кишечнике.

Условия микроциркуляции, представленные скоростью кровотока и скоростью сдвига стенок, обычно существенно не различаются между соответствующими экспериментальными группами с различным лечением хемокинами. Местное лечение мышечной ткани кера с помощью различных хемокинов или медиаторов воспалительной реакции. Например, фактор 1 альфа, производный из стромальных клеток, или фактор некроза опухоли альфа, способен имитировать определенные условия микросреды.

Такие условия усиливают взаимодействие эндотелиальных клеток стволовых клеток в различной степени в зависимости от конкретного применяемого хемокина или медиатора и вводимой популяции стволовых клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать взаимодействие стволовых клеток и клеток in vivo с помощью прижизненной микроскопии мышечной микроциркуляции CreER.