Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Общая цель следующего эксперимента заключается в разработке модели культуры нейронов человека, идентификации нейрональных маркеров и выделении чистой популяции нейронов для анализа экспрессии генов. Для этого сначала проводят экспансию нейральных стволовых клеток человека для создания постоянного запаса клеток-предшественников. На втором этапе нейральные стволовые клетки культивируют в присутствии добавок для дифференцировки и нейротрофических факторов роста в чашках, покрытых факторами адгезии.

Затем проводят иммунофлуоресцентное окрашивание на нейрональные маркеры, чтобы определить судьбу дифференцированных нейральных клеток-предшественников. В завершение выполняется лазерная микродиссекция нейронов, культивируемых на предметных стеклах с ПЭН-мембраной, для последующего анализа экспрессии нейрон-специфических генов. Полученные результаты показывают, что дифференцированные нейральные клетки-предшественники имеют преимущественно нейрональную природу.

На основании иммунофлуоресцентного окрашивания и захвата нейронов с помощью лазерной микродиссекции из человеческих нейропрогениторных клеток могут быть получены и дифференцированы культуры, богатые нейронами. Для исследований in vitro, поскольку в таких культурах присутствуют глиальные клетки, можно использовать лазерную микродиссекцию для выделения чистой популяции нейронов.

Эти процедуры продемонстрирует Рон Бушард, старший научный сотрудник нашего центра микроскопии. Для начала процедуры разморозьте замороженный сток нейрональных прогениторных клеток человека, выделенных из мозга плода, путем быстрого нагрева до 37 °C, а затем перенесите их в T 75, содержащий 15 мл предварительно нагретой базовой нейрональной среды, дополненной 10 нг/мл EGF и FGF. После культивирования клеток в течение трех дней перенесите нейросферы в пробирку объемом 15 мл и осадите их центрифугированием при 1000 об/мин в течение пяти минут. После центрифугирования удалите супернатант, оставив около 100 мкл среды, и перенесите осадок клеток в пробирку типа «эппендорф».

Осадка клеток объемом 100 µL достаточно для распределения в две колбы T 75. Если объем меньше, уменьшите количество колб, так как нейрогенные клетки-предшественники перестанут пролиферировать. При распределении в малом количестве тщательно разрушайте нейросферы до получения суспензии одиночных клеток, прокачивая содержимое через пипетку 50 раз, прижимая наконечник объемом 200 µL к дну пробирки.

Визуально контролируйте процесс с помощью микроскопа, чтобы убедиться в диссоциации нейросфер. Затем разделите клеточную суспензию поровну и перенесите ее в два флакона T 75: один — для дальнейшего экспансирования, другой — для дифференцировки.

Затем инкубируйте колбы. Замените среду нейральных прогениторных клеток в колбе, предназначенной для экспансии, путем центрифугирования. Затем удалите старую среду и добавьте новую среду.

Заменяйте среду каждые четыре-пять дней, пока нейросферы не достигнут исходного размера от 300 до 500 микрон. Чтобы начать дифференцировку нейральных клеток-предшественников в культуру, обогащенную нейронами, поместите по одному покровному стеклу в каждую лунку 24-луночного планшета и проведите покрытие, добавив в каждую лунку 500 µL поли-L-лизина в концентрации 100 µg/mL. Инкубируйте планшеты в течение 30 минут при комнатной температуре, затем аспирируйте раствор поли-L-лизина.

Промойте планшет деионизированной стерильной водой и снова удалите жидкость с помощью аспиратора. Затем заполните лунки планшета 500 µL ламинина мыши в концентрации 5 µg/mL и инкубируйте в течение 30 минут. После инкубации промойте лунки раствором PBS, снова удалите жидкость аспиратором и оставьте их высыхать в ламинарном шкафу для культуры тканей. Через четыре дня после пассирования клеток перенесите небольшие нейросферы из колбы, предназначенной для дифференцировки, в подготовленный 24-луночный планшет.

Добавьте нейросферы с плотностью около 500 на лунку. После инкубации в течение шести часов, когда нейросферы прикрепятся к планшету, удалите среду для пролиферации и добавьте среду для дифференцировки. Среда для дифференцировки состоит из среды Neurobasal с добавками B 27, N-G-F-B-D-N-F-D-B-C и ретиноевой кислотой. Верните планшет в инкубатор. После культивирования нейрональных клеток-предшественников в среде для нейрональной дифференцировки в течение двух недель получается культура, обогащенная нейронами.

Промойте нейроны один раз в PBS, затем зафиксируйте их в 4% параформальдегиде в течение 30 минут. После фиксации трижды промойте клетки в PBS. Затем подготовьте клетки к иммуноокрашиванию, инкубируя их с пермеабилизирующим буфером при комнатной температуре в течение 60 минут.

Затем в лунки добавьте поликлональные и моноклональные антитела в 3% BSA в PBS. Добавьте в каждую лунку разную пару антител и инкубируйте их в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия на шейкере. На следующее утро трижды промойте покровные стекла PBS, а затем инкубируйте их со вторичными антителами anti-rabbit P SI three и anti-US fitzy при комнатной температуре в темноте в течение 90 минут после инкубации.

Промойте покровные стекла трижды в PBS. Затем нанесите 10 µl среды для заключения на предметное стекло. Извлеките покровное стекло из культуральной чашки и поместите его срезом вниз на среду для заключения.

Осторожно удалите излишки среды для заключения и загерметизируйте края лаком для ногтей. Чтобы подготовить клетки к микродиссекции, сначала дифференцируйте нейральные клетки-предшественники в культуру, обогащенную нейронами, на мембране из PEN. Используйте предметные стекла, покрытые поли-L-лизином и ламинином.

Все последующие этапы следует проводить в условиях отсутствия РНКаз. Затем окрасьте культуры с помощью гистологического красителя для визуализации клеток; этот краситель окрашивает ядра в пурпурный цвет, а цитоплазму — в светло-розовый, что позволяет легко дифференцировать нейроны и глиальные клетки по их характерной морфологии. Поместите предметное стекло в 75% ethanol и деионизированную стерильную воду на 30 секунд.

Затем поместите предметное стекло на салфетку Kim wipe. Добавьте 200 µL histo gene и подождите 20 секунд. После этого последовательно помещайте предметное стекло на 30 секунд в деионизированную стерильную воду, 75% ethanol, 95% ethanol и 100% ethanol.

Затем поместите образец в ксилол на пять минут и просушите с помощью салфетки Kim wipe в течение пяти минут. После этого наложите слайд с PEN-мембраной поверх обычного предметного стекла и поместите их в систему лазерной микродиссекции Veritas (LCM), используя соответствующее программное обеспечение. Сделайте обзорное изображение (roadmap image), чтобы определить области с чистыми популяциями нейронов, не содержащие астроцитов.

Отметьте эти нейроны с помощью инструментов рисования. Затем проведите лазерный захват этих областей, используя компьютерное управление, высокую точность и автоматизацию в двухэтапном процессе. Сначала ИК-излучение направляется на несколько точек при мощности лазера 70 milliwatts и длительности импульса 2, 500 microseconds для прикрепления мембраны к колпачку.

Затем отмеченная область вырезается с помощью УФ-резака при низкой настройке мощности 10 millivolts. Сочетание этих процессов позволяет селективно переносить отмеченные области на макрокрышки для сбора LCM. После того как будет собрано не менее 100 нейронов, с помощью микроскопа снимите мембрану с крышки и поместите ее в пробирку.

Выделите общую РНК из образцов, полученных методом лазерной микродиссекции (LCM), используя набор для выделения РНК P OPU, и обработайте её ДНКазой. Затем амплифицируйте выделенную РНК с помощью набора для амплификации РНК ribo amp, следуя инструкциям к набору. В завершение проведите анализ методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-qPCR) с использованием зондов TAC MAN для обнаружения тяжелой цепи нейрофиламента человека.

Культура, обогащенная нейронами, получается путем дифференцировки четырехдневных нейросфер с использованием поверхностей, покрытых поли-L-лизином и ламинатом, в сочетании со специфическими факторами роста для дифференцировки. Через две недели в областях с низкой плотностью клеток получается представленная здесь культура, обогащенная нейронами. Клетки могут дифференцироваться в астроциты, подобные тем, что видны здесь.

Дифференцировку астроцитов также можно направить, используя фактор роста CNTF вместо факторов, применяемых для дифференцировки нейронов. Дифференцировку нейронов можно определить с помощью антител к специфическим нейрональным маркерам: NeuN и синапсину, ацетилхолинэстеразе и синаптофизину, а также BDNF и GAP 43. Положительное окрашивание свидетельствует о том, что дифференцированные клетки обладают характеристиками первичных нейронов. Кроме того, астроциты можно идентифицировать с помощью положительного иммуноокрашивания на Stat3 и GFAP.

Лазерная захватная микродиссекция нейронов проводится на клетках, дифференцированных на предметных стеклах с ПЭН-мембраной, покрытой поли-L-лизином и ламинином; здесь представлены нейроны, окрашенные гистологическим красителем. Для визуализации клеток интересующие объекты обводят лазером, который расплавляет ПЭН-мембрану, в результате чего она прилипает к крышке для захвата, расположенной над ней. В итоге можно обвести и собрать на одной крышке множество клеток для последующего анализа ДНК или РНК.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать нейроны с помощью лазерной захватывающей микродиссекции.