Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Общая цель данного эксперимента заключается в разработке модели культуры нейронов человека, идентификации нейронных маркеров и выделении чистой популяции нейронов для анализа экспрессии генов. Это достигается за счет расширения нейронных клеток-предшественников человека для создания непрерывного запаса клеток-предшественников. В качестве второго шага нейропрогениторные клетки культивируют в присутствии дифференцировочных добавок и нейротрофических факторов роста в чашках, покрытых факторами прикрепления.

Далее проводится иммунофлуоресцентное окрашивание на нейрональные маркеры для определения судьбы дифференцированных клеток-предшественников нейропредшественников. Наконец, выполняется лазерная захватывающая микродиссекция нейронов, культивируемых на PEN-мембранных предметных стеклах, чтобы облегчить анализ экспрессии специфических генов нейронов. Получены результаты, которые показывают, что дифференцированные нейропрогениторные клетки имеют преимущественно нейронную природу.

Основан на иммунофлуоресцентном окрашивании и захвате нейронов. С помощью микродиссекции лазерного захвата клетки-предшественники человеческого нейропредшественника могут быть расширены и дифференцированы в культуры, богатые нейронами. Для исследований in vitro, поскольку эти культуры содержат некоторые клетки gal, мы можем использовать микродиссекцию лазерного захвата для выделения чистой популяции нейронов.

Эти процедуры будет демонстрировать Рон Бушар, старший научный сотрудник нашего микроскопа. Чтобы начать эту процедуру, оживите замороженный запас человеческих нейропрогениторных клеток, выделенных из мозга плода, быстро нагрев их до 37 градусов Цельсия, а затем добавив их в T 75, содержащий 15 миллилитров предварительно разогретой нейробазальной среды, с добавлением 10 нанограммов на миллилитр, EG, F и FGF. После культивирования клеток в течение трех дней перенесите нейросферы в 15-миллилитровую пробирку и гранулируйте их центрифугированием при 1000 об/мин в течение пяти минут после центрифугирования, выбросьте надосадочную жидкость, оставив около 100 микролитров среды, и перенесите клеточную гранулу в эйнорскую трубку.

Гранулы ячейки объемом 100 микролитров достаточно, чтобы разделить на две колбы T 75. Если меньше, уменьшите количество колб, так как нейропрогениторные клетки не могут размножаться. Если расщепить тонким слоем, то тщательно разбить нейросферы на одноклеточную суспензию, пипетируя вверх и вниз 50 раз, удерживая наконечник объемом 200 микролитров на дне пробирки.

Визуально контролируйте прогресс с помощью микроскопа, чтобы убедиться в диссоциации нейросфер. Далее разделите клеточную суспензию поровну и добавьте ее в две колбы Т 75. Один для продолжения расширения, а другой для дифференциации.

Затем инкубируйте колбы. Измените среду нейроклеток-предшественников в колбе, помеченной для расширения, путем центрифугирования. Затем отбрасывая старый носитель и добавляя новый.

Меняйте среду каждые четыре-пять дней, пока нейросферы не достигнут своего первоначального размера от 300 до 500 микрон. Чтобы начать дифференцировку клеток нейропредшественников в богатую нейронами культуру, поместите одну защитную пластину в каждую лунку 24-луночного планшета и покройте ее, добавив в каждую из них 500 микролитров поли-L-лизина по 100 микрограммов на миллилитр. Хорошо инкубируйте посуду в течение 30 минут при комнатной температуре, затем аспирируйте раствор полиола лизина.

Промойте пластину деионизированной стерильной водой и снова аспирируйте. Затем покройте лунки планшета 500 микролитрами пяти микрограммов на миллилитр, мышиным ламинином и инкубируйте в течение 30 минут после инкубации, снова промойте лунки аспиратом PBS и поставьте их сушиться в вытяжку для культуры тканей. Через четыре дня после расщепления клеток перенесите маленькие нейросферы из колбы, помеченной для дифференцировки, в покрытую 24-луночную пластину.

Добавьте плотность около 500 нейросфер в лунку после инкубации в течение шести часов, когда нейросферы прикрепятся к чашке, удалите пролиферирующую среду и добавьте дифференцировку. Среда состоит из нейробазальной среды В 27 добавки N-G-F-B-D-N-F-D-B-C и ретиноевой кислоты. Возвращают планшет в инкубатор после культивирования нейропрогениторных клеток в среде для дифференцировки нейронов в течение двух недель, получают культуру, богатую нейронами.

Промойте нейроны один раз в PBS, а затем зафиксируйте их в 4%-ном параформном альдегиде на 30 минут. После фиксации трижды промойте клетки PBS. Затем подготовьте клетки к иммуноокрашиванию, инкубируя их с проницаемым буфером при комнатной температуре в течение 60 минут.

Далее добавьте в лунки поликлональные и моноклональные антитела в 3% БСА в PBS. Добавив в каждый из них разную пару антител, на следующее утро инкубируйте их в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в шейкере. Промойте крышки три раза PBS, а затем инкубируйте их с антителами против кролика P SI три и вторичными антителами против US fitzy при комнатной температуре в темноте в течение 90 минут после инкубации.

Промойте чехлы три раза с помощью PBS. Затем поместите 10 микролитров монтажного материала на предметное стекло. Выньте защитный лист из чашки для культивирования и положите его вверх дном на монтажный материал.

Аккуратно сотрите излишки монтажной среды и заклейте края лаком для ногтей. Чтобы подготовить клетки к микродиссекции, сначала дифференцируйте клетки-предшественники нейропредшественников в богатую нейронами культуру на мембране PEN. Слайды покрыты поли-L лизином и ламинином.

Выполняйте все последующие шаги в условиях отсутствия РНК. Затем окрашивайте культуры с помощью окрашивания гистогеном, чтобы визуализировать клетки гистогена, окрашивая ядра в фиолетовый цвет, а цитоплазму светло-розового цвета, что облегчает дифференциацию нейронов и глиальных клеток по их различной морфологии. Поместите предметное стекло в 75% этанол и деионизированную стерильную воду на 30 секунд.

Затем поместите предметное стекло на салфетку Кима. Добавьте 200 микролитров гистогена и подождите 20 секунд. Затем поместите предметное стекло последовательно на 30 секунд в деионизированную стерильную воду, 75% этанола, 95% этанола и 100% этанола.

Затем поместите в ксилол на пять минут и высушите на салфетке Кима в течение пяти минут. Затем поместите PEN-мембрану Слайд на обычное предметное стекло и поместите их в систему лазерного захвата Veritas для микродиссекции или LCM с помощью программного обеспечения. Сделайте изображение дорожной карты, чтобы найти области чистых нейронных популяций, лишенных астроцитов.

Отметьте эти нейроны с помощью инструментов рисования. Затем выполните лазерный захват этих областей с помощью компьютерного управления и автоматизации в два этапа. Во-первых, ИК-излучение подается в несколько точек с настройкой мощности лазера 70 милливатт и импульсом 2500 микросекунд для прикрепления мембраны к колпачку.

Далее отмеченный участок вырезается с помощью УФ-режущего инструмента при низком уровне 10 милливольт. Комбинация этих процессов позволяет выборочно захватывать отмеченные области на колпачках макросов LCM. Когда будет захвачено минимум 100 нейронов, используйте микроскоп, чтобы снять мембрану с колпачка и поместить ее на трубку.

Выделите общую РНК из образцов LCM с помощью набора для выделения P OPU RNA и обработайте ДНК. Затем амплифицируйте выделенную РНК с помощью набора для амплификации РНК ribo amp, следуя инструкциям из набора. Наконец, выполните анализ R-T-P-C-R в режиме реального времени с помощью зондов TAC MAN для обнаружения тяжелой цепи нейрофиламента человека.

Богатую нейронами культуру получают путем дифференцировки четырехдневных нейросфер с использованием поли-Lлизина и покрытых ламинатом поверхностей в сочетании со специфичными для дифференцировки факторами роста. Через две недели показанная здесь культура, богатая нейронами, получается в областях с низкой плотностью. Клетки могут дифференцироваться в астроциты, подобные тем, которые мы видим здесь.

Дифференцировка астроцитов также может быть направлена с использованием фактора роста CNTF вместо тех, которые используются для дифференцировки нейронов. Дифференцировка нейронов может быть идентифицирована с помощью антител к специфическим нейронным маркерам, новым N и синапсину, ацетилхолинэстеразе и синаптофизину, а положительное окрашивание BDNF и GAAP 43 является доказательством того, что дифференцированные клетки обладают характеристиками первичных нейронов. Кроме того, астроциты могут быть идентифицированы с помощью положительного показателя три и иммуноокрашивания GAP.

Лазерная захватывающая микродиссекция нейронов выполняется на клетках, которые были дифференцированы на PEN-мембране, покрытой поли-L лизином и ламинином. Чтобы визуализировать клетки, интересующие их клетки затем могут быть обведены с помощью лазера, который плавит мембрану PEN, заставляя ее прилипать к захватному колпачку, расположенному над ней. В конце концов, многочисленные клетки могут быть очерчены и захвачены на одном и том же колпачке для анализа ДНК или РНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать нейроны с помощью микродиссекции лазерного захвата.