Цифровой Инлайн Голографическая микроскопия (DIHM) субъектов слабо-рассеяния
February 8th, 2014
Трехмерные местоположения слабо рассеивающих объектов может быть однозначно определены с помощью цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM), которая включает в себя незначительные изменения в стандартный микроскоп. Наше программное обеспечение использует простой визуализации эвристики в сочетании с Рэлея-Зоммерфельда обратного распространения, получая трехмерное положение и геометрию объекта микроскопической фазовой.
Общая цель данного эксперимента — реконструировать трехмерное положение в геометрии цепи плавающих бактериальных клеток. Это достигается путем предварительного выращивания бактериальных клеток до нужной концентрации, чтобы получить подходящий образец для визуализации. В качестве второго шага светодиодный источник света настраивается и выравнивается, что позволяет получать голографические изображения.
Далее используется программное обеспечение для реконструкции для получения 3D-координат цепочки бактериальных клеток. Результаты показывают возможность реконструкции 3D-положения и конфигурации бактериальных клеток на основе голографической визуализации. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, заключается в том, что объемная визуализация без меток возможна с высокой частотой кадров.
Для начала инокуляции 10 миллилитров среды KTY с кристаллами льда из замороженного запаса стрептококка штамма V 4 0 5 1 1 97 инкубируют закваску в ротационном шейкере в течение ночи при температуре 35 градусов Цельсия и 150 об/мин. Как только он вырастет, завите 10 миллилитров свежей среды KTY с 500 микролитрами из насыщенной закваски. Инкубируйте в течение 3,5 часов при температуре 35 градусов Цельсия и 150 оборотах в минуту, пока клетки не достигнут оптической плотности на длине волны 600 нанометров от 0,8 до 1,0.
Это составляет примерно пять умножить на 10 до восьмой клетки на миллилитр. Затем разбавьте клетки в соотношении один к 400 в свежей среде, чтобы получить конечную концентрацию примерно 1 миллион клеток на миллилитр. Далее наполните шприц вазелином и сделайте на предметном стекле микроскопа кольцо из смазки высотой в один миллиметр.
Затем поместите каплю раствора образца в центр. Аккуратно наденьте покровное стекло на образец и слегка надавите на стекло, чтобы закрыть края, убедившись, что жидкость контактирует как со предметным стеклом, так и с покровным стеклом. Полученная камера для образцов должна иметь глубину от 100 до 200 микрометров.
Поверните 60-кратную масляную иммерсионную линзу на место и добавьте каплю масла. Затем поместите камеру для образца на предметный столик микроскопа покровным стеклом вниз. Следите за тем, чтобы между стеклозащитной крышкой и линзой не образовывались пузырьки воздуха.
Сфокусируйтесь на нижней поверхности камеры образца, а затем сфокусируйтесь на конденсаторе. Далее выключите штатную подсветку и поместите светодиодную головку за апертуру конденсора микроскопа. Убедитесь, что конденсатор установлен в режим яркого поля, и установите источник питания светодиодов на максимальную мощность.
Затем закройте апертуру конденсора на полную катушку и сдвиньте светодиод в креплении до тех пор, пока свет не будет центрироваться на диафрагме объектива. Включите компьютер и перенаправьте световой путь на порт камеры микроскопа. Отрегулируйте частоту кадров до 30 кадров в секунду и размер изображения до пяти 12 на пять 12 пикселей в программном обеспечении для получения изображений.
Проверьте гистограмму интенсивности изображения, чтобы убедиться, что ни одна часть изображения не является насыщенной или недоэкспонированной. Время экспозиции кадра должно быть как можно короче при сохранении хорошего контраста. Если клетки собираются близко к границе раздела, перефокусируйте микроскоп так, чтобы бактериальные клетки были немного расфокусированы.
Клетки должны лежать на расстоянии от 10 до 30 микрон от фокальной плоскости для оптимальной реконструкции. После перефокусировки получите серию видеокадров и сохраните в несжатом виде файл VI. Затем запустите программное обеспечение DIHM, доступное для бесплатной загрузки, чтобы преобразовать видеокадр в набор изображений с цифровой перефокусировкой.
Примеры рам поставляются с программным обеспечением для начала реконструкции. Введите интересующую рамку и ее фон в виде отдельных файлов изображений в поля. Фоновое изображение точно представляет фон видео в отсутствие голограммы и будет использоваться для подавления любого фиксированного шума, который может помешать голографической локализации и анализу.
Далее введите параметры стека вывода в глобальные поля настроек. Сначала введите осевое положение первого кадра в начальном фокусе. Затем введите количество срезов в восстановленном стеке в поле Количество шагов и, наконец, введите фактическое расстояние между каждым срезом в стеке в поле Размер шага.
Установите размер шага таким же, как расстояние между боковыми пикселями, чтобы воссоздать объекты с правильными пропорциями с использованием данных примера. Это значение должно составлять 0,233 микрометра. Затем введите освещенность камеры, длину волны и средний показатель преломления, а также частоту боковой дискретизации.
В квадрате пикселей на микрон частоту боковой дискретизации камеры можно найти, разделив увеличение объектива на размер пикселя сенсора камеры. Используя данные примера, это число будет равным 60 x разделить на 14 микрометров, что равно 4,29 пикселя на микрон. Затем, если центр объекта на голограмме темный, нажмите кнопку переворачивания градиента Z.
При этом будет применен фильтр, который извлекает объекты ниже фокальной плоскости в исходном образце. Затем включите полосовой фильтр, который отвечает за подавление зашумленного вклада пикселей в изображение. Он применяется к каждому фрагменту изображения сразу после генерации.
Затем проверьте состояние выключения промежуточного выхода и убедитесь, что они включены. Когда эти переключатели включены, это приведет к созданию двух видео. Первый стек — это стек перефокусировки с именем файла, оканчивающимся на стек a V. Второй стек — это фактическая операция градиента с именем файла, оканчивающимся на градиент a VI. В идеале этот второй стек будет содержать интересующий объект и выделенный как яркий объект на темном фоне.
После установки всех параметров нажмите кнопку «Выполнить» в главном окне для выполнения команд. Выбранный кадр появится в основной коробке программного обеспечения. Затем используйте инструмент «Лупа», расположенный на панели инструментов слева от изображения, чтобы увеличить или уменьшить масштаб.
Используйте инструмент «Прямоугольник», чтобы выбрать область интереса или ROI и захватить как можно больше полос голограммы внутри прямоугольника для оптимизации реконструкции. Наконец, нажмите кнопку процесса, чтобы создать два отдельных стека изображений. Проверьте полученные стеки с помощью изображения J, доступного на этом веб-сайте.
Если интересующий объект хорошо виден в стеке градиентных изображений, перейдите в раздел рендеринга для извлечения координат объекта. Чтобы начать рендеринг, нажмите кнопку извлечения объектов, чтобы включить функцию определения местоположения по координатам X, Y, Z. Затем введите путь и расширение для файла выходных координат, выберите стиль луча POV в поле стиля выходных координат.
Это приводит к тому, что программа записывает объектный файл, который может быть визуализирован с помощью бесплатного программного обеспечения для трассировки лучей от первого лица, который можно получить на этом веб-сайте, повторно обрабатывает изображения для извлечения координат объектов. Программа предоставит ряд координат X, Y, Z в выбранном ROI, записанный на имя файла в поле выходных кабелей. Извлечение координат объекта занимает значительно больше времени, чем генерация стеков.
Убедитесь, что образец файла POV ray, поставляемый с кодом реконструкции, находится в той же папке, что и файл выходных координат. Отредактируйте образец файла dot pov и замените имя файла на кавычки в строке. Включите мой файл NC с именем файла данных, сгенерированного кодом реконструкции.
Затем настройте положение камеры, освещение, текстуру и параметры рендеринга в лучах от первого лица. Когда закончите, нажмите кнопку «Выполнить», чтобы отобразить растровое изображение. Это изображение цепи бактерий стрептококка, которая была мгновенно ориентирована.
Закончите на фокальной плоскости. Объекты в этой конфигурации трудно реконструировать и обычно дают большой двоичный объект, близкий к фокальной плоскости. Здесь показано правильно визуализированное изображение, представляющее большинство кадров этой серии, в которых цепь не ориентирована непосредственно вдоль оптической оси.
Форма и положение объекта точно воспроизведены на визуализации, как видно на панели справа. Как только эта техника будет освоена, это можно будет сделать за считанные минуты.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование демонстрирует использование цифровой встроенной голографической микроскопии (DIHM) для восстановления трехмерных позиций и геометрии плавающих бактериальных клеток. Метод позволяет проводить объемное изображение без меток с высокой частотой кадров, что обеспечивает значительное преимущество перед традиционными методами.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биофизика
- Методы визуализации
Фон
- Цифровая встроенная голографическая микроскопия (DIHM) является модифицированной микроскопической техникой.
- Она позволяет уникально идентифицировать слабо рассеивающие объекты в трех измерениях.
- Голографическая визуализация может захватывать динамические процессы в реальном времени.
- Существующие методы, такие как конфокальная микроскопия, часто требуют маркировки, которая может изменить поведение биологических образцов.
Цель исследования
- Восстановить 3D позиции и геометрию плавающих бактериальных клеток.
- Демонстрировать эффективность DIHM в изображении живых клеток.
- Сравнить преимущества DIHM с традиционными методами визуализации.
Использованные методы
- Подготовка культур бактериальных клеток при соответствующих концентрациях.
- Расстановка светодиодного источника света для оптимального голографического изображения.
- Использование программного обеспечения для реконструкции для получения 3D координат.
- Анализ полученных голографических изображений для оценки конфигурации клеток.
Основные результаты
- 3D позиции бактериальных клеток были успешно восстановлены.
- Метод продемонстрировал изображение с высокой частотой кадров без необходимости в метках.
- Результаты показали явное преимущество перед конфокальной микроскопией в плане скорости изображения и целостности образца.
- Голографическая визуализация оказалась эффективной для динамических биологических процессов.
Выводы
- DIHM является мощным инструментом для изучения динамики живых бактериальных клеток.
- Метод позволяет проводить детальное 3D изображение без изменения образца.
- Эта техника может быть применена в различных областях биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Digital inline holographic microscopy (DIHM) enables label-free volumetric imaging of weakly-scattering biological samples at high frame rates, addressing a key limitation in live-cell imaging where traditional methods require labeling or lack 3D spatial resolution. This capability supports early discovery workflows by providing quantitative, model-free measurements of cellular position and geometry in native conditions, reducing mechanistic ambiguity in target validation and phenotypic screening. The technique’s compatibility with standard imaging hardware and scalable sample volumes positions it as a reusable platform for de-risking therapeutic hypotheses in discovery biology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables unambiguous, model-free measurement of object location and shape in microscopic samples, supporting therapeutic hypothesis interrogation without exogenous labels.
- Operational Value: Uses standard CMOS/CCD cameras and LED or laser illumination, allowing integration into existing microscopy workflows without specialized reagents.
- Predictive Value: Provides quantitative 3D coordinates of cellular structures, facilitating functional target validation and biological de-risking through direct observation of native dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Captures interference patterns that contain depth information for 3D reconstruction, enabling label-free assessment of cellular responses in complex microenvironments.
- Operational Value: Defines accessible sample volume via camera sensor size and illumination coherence, supporting standardization across platforms with volumes up to 5 mm³ using laser illumination.
- Predictive Value: Employs Rayleigh-Sommerfeld back propagation and Gouy phase anomaly heuristics to generate reproducible, quantitative outputs for assay readiness and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time observation of dynamic biological processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Allows high-frame-rate imaging without sample alteration, preserving native behavior for longitudinal tracking in preclinical models.
- Predictive Value: Delivers mechanistic de-risking by reducing ambiguity in cellular geometry and positioning, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
DIHM fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to lead identification and preclinical validation, particularly where label-free, volumetric, and dynamic imaging are required to compare experimental conditions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing model-free 3D localization of weakly-scattering objects like bacterial cells or subcellular structures.
- Screening: Enables assay readiness through quantitative, refocused image stacks that allow comparison of cellular configurations across conditions.
- Analytics: Generates X, Y, Z coordinate outputs via feature extraction, enabling statistical analysis of spatial distributions and motion patterns.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving sample integrity during longitudinal imaging of dynamic processes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability rather than a single-use technique, leveraging free reconstruction software and standard hardware.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through label-free, model-free 3D reconstruction of object geometry and position.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via numerical refocusion and fixed-pattern noise suppression using background subtraction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early, high-fidelity observation of native cellular dynamics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via quantitative spatial data that informs target confidence and lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in holographic image acquisition and numerical reconstruction using Rayleigh-Sommerfeld back propagation.
- Needs instrumentation capable of plane-wave illumination and CMOS/CCD image capture at defined frame rates and resolutions.
- Demands cross-team standardization of illumination coherence, step size, and lateral sampling frequency for reproducible 3D reconstruction.
- Requires adaptation of output stack parameters (start focus, number of steps, step size) to match experimental scale and magnification.
- Practical limitation: optimal reconstruction requires objects to lie 10–30 microns from the focal plane, necessitating precise sample preparation and focusing.
