Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши

Общая цель данной процедуры — изолировать сосудистую сеть сетчатки. Это достигается путем первоначального проведения серии промывок изолированной сетчатки водой. На втором этапе сетчатку подвергают перевариванию трипсином при 37 °C в течение примерно одного — полутора часов, в зависимости от размера сетчатки.

Затем сосудистая сеть изолируют путем дополнительных промывок водой и диссекции под микроскопом. В конечном итоге можно визуализировать патологические изменения сосудов, такие как микроаневризмы, дегенерация капилляров и аномальное соотношение эндотелиальных клеток к количеству паразитов. Таким образом, основным преимуществом метода try and digest по сравнению с существующими методами, такими как приготовление плоских препаратов сетчатки, является возможность с высокой четкостью выделить всю сосудистую сеть.

Как правило, люди, впервые осваивающие этот метод, сталкиваются с трудностями, так как он технически сложен и требует высокой точности при повторном выполнении. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, поскольку этапы изоляции сосудов трудно изучить только по текстовому описанию. Этот метод является очень ценным инструментом для любой лаборатории, занимающейся исследованиями биологии сосудов сетчатки, например, при таких заболеваниях, как диабетическая ретинопатия; демонстрировать данную технику будет Джонатан Чоу, талантливый студент-медик из моей лаборатории.

После фиксации энуклеированного глаза мыши в 10% нейтральном фосфатном буфере с формалином в течение 24 часов поместите глаз в чашку Петри и залейте небольшим количеством воды. Начните диссекцию, используя диссекционные ножницы, чтобы аккуратно сделать первый разрез в роговице. Затем, удерживая область разреза прямыми пинцетом, с помощью ножниц вырежьте роговицу, двигаясь вдоль границы роговицы и склеры.

Затем используйте тонкие изогнутые и прямые пинцеты, чтобы медленно и осторожно отделить склеру и сосудистую оболочку от сетчатки в направлении зрительного нерва. После этого удалите хрусталик, остатки радужки и любые посторонние частицы с сетчатки, чтобы облегчить отделение нейрональных слоев сетчатки от кровеносных сосудов.

Добавьте приблизительно 500 µL воды, отфильтрованной через фильтр 45 µm, в планшет на 24 лунки, поместите сетчатку в лунку, затем осторожно встряхивайте в течение четырех-пяти часов при комнатной температуре, меняя воду каждые 30–60 минут. Продолжайте промывать сетчатку в воде в течение ночи при осторожном встряхивании. На следующий день при комнатной температуре удалите воду и добавьте 3% трипсин; проверьте образец под микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии дебриса в лунке. Чтобы предотвратить прилипание сосудов, инкубируйте ткань при 37 °C без встряхивания или при очень слабом встряхивании в течение одного-полутора часов.

Когда ткани начнут проявлять признаки деградации, поместите планшет на предметный столик микроскопа, избегая при этом касания сетчатки. Осторожно удалите трипсин, чтобы отделить сосудистую сеть. Сначала с помощью пинцета добавьте на сетчатку фильтрованную воду.

Снимите внутреннюю пограничную мембрану, которая выглядит как тонкий прозрачный слой. Встряхните планшет с осторожной амплитудой. Через пять минут снова поместите планшет на предметный столик микроскопа и аккуратно замените воду, стараясь не повредить сетчатку, чтобы помочь освободить сеть сосудов от прилипшей ткани сетчатки.

Промывайте сетчатку, как было только что продемонстрировано, до тех пор, пока после последнего промывания в воде почти не останется никакого мусора. Как правило, удаление всей неваскулярной ткани является самой сложной частью процедуры. Следующие методы можно использовать как последовательно, так и по отдельности. Для облегчения изоляции сосудистой сети одним важным советом является погружение всех инструментов и трипсина перед манипуляциями с сетчаткой.

Это поможет предотвратить прилипание ткани к оборудованию. Смажьте наконечник микропипетки на 200 µL зарезервированным трипсином, затем осторожно перемещайте воду вверх и вниз рядом с сосудами сетчатки и в их направлении, создавая легкое перемешивание. Если неваскулярная ткань в центре по-прежнему сопротивляется, поместите смазанный трипсином наконечник микропипетки в область зрительного нерва и осторожно перемещайте воду вверх и вниз по всей сети сосудов, чтобы помочь разрушить неваскулярную ткань.

Наконец, с помощью пинцета можно аккуратно приподнять сосудистую сеть над водой, чтобы удалить любые прилипшие несосудистые компоненты. Конечным результатом должна быть целая, очищенная от детрита сеть сосудов сетчатки.

Для визуализации сосудистой сети сначала поместите каплю воды на чистый предметное стекло. Затем перенесите переваренные сосуды в воду, контролируя процесс под микроскопом. Если препарат сосудов (VA) в закрепленном состоянии сложен или развернут, следует учитывать, что сложенные сосуды приводят к плохой видимости.

Если при окрашивании ткань оказалась сложенной, добавьте немного воды и осторожно встряхните предметное стекло, чтобы способствовать ее расправлению. Затем с помощью микропипетки медленно удалите излишки воды. Конечным результатом успешной процедуры является плоский препарат всей сети сосудов сетчатки мыши с сохраненной архитектурой, окрашенный гематоксилином и эозином.

Как показано здесь, на данном изображении в сетчатке можно наблюдать четкую дифференциацию между эндотелиальными клетками и перицитами. Ядра эндотелиальных клеток, отмеченные белой стрелкой, имеют овальную или вытянутую форму и полностью расположены внутри стенки сосуда. Ядра паразитов, отмеченные черной стрелкой, маленькие, сферические, интенсивно окрашены и обычно выступают за пределы стенки капилляра.

Трипсинизация и переваривание (trypsin and digest) — это стандартная процедура, используемая для анализа сосудистой патологии на моделях диабета у животных. На данном изображении показан пример дегенерации капилляров, отмеченный белой стрелкой, который наблюдается у мыши линии DB DB, являющейся моделью сахарного диабета 2-го типа. Хотя эта процедура была оптимизирована для сеточатки мыши, аналогичные результаты могут быть получены и при исследовании сетчатки крысы.

Важно отметить, что сетчатки крыс, представленные на этих изображениях, крупнее сетчаток мышей и требуют использования 12-луночных, а не 24-луночных планшетов. Сосудистая сеть сетчатки крысы также менее хрупкая, чем у мыши. Крайне важно удалить как можно больше неваскулярной ткани.

Любые остатки приведут к неспецифическому окрашиванию и затруднят визуализацию сосудов. На данном изображении, например, виден результат неудачного удаления всей неваскулярной ткани. Кроме того, при закреплении важно развернуть сетчатку, чтобы улучшить визуализацию сосудистой сети.

На этом изображении показан неудачный результат развертки сосудистой сети (flat mount). После освоения этой технически сложной процедуры метод препарирования и переваривания тканей может стать чрезвычайно ценным инструментом, позволяющим детально визуализировать всю сосудистую сеть.

Совершенствуя этот метод на примере глаза мыши, исследователи могут использовать генетически модифицированных мышей для изучения различных путей регуляции сосудистой сети сетчатки, что позволит понять патофизиологию различных заболеваний сетчатки. Благодаря этому мы можем углубить понимание патологий, таких как диабетическая ретинопатия. Изучение моделей мышей, например, мышей DVDB, в конечном итоге может дать возможность найти новые потенциальные терапевтические методы воздействия на сосуды сетчатки.