Трипсин Digest протокола для анализа сосудистой сети сетчатки модели мыши

Общая цель этой процедуры заключается в изоляции сосудистой сетки сетчатки. Это достигается путем проведения серии водных промываний изолированной сетчатки. На втором этапе сетчатка расщепляется в трипсине при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно одного-полутора часов, в зависимости от размера сетчатки.

Далее сосудистая сеть изолируется с помощью дополнительных водных промываний и диссекции под микроскопом. В конечном счете, можно визуализировать патологические сосудистые изменения, такие как микроаневризмы, капиллярная дегенерация и аномальное соотношение эндотелиальных клеток и паразитов. Таким образом, основное преимущество try and digest по сравнению с существующими методами, такими как подготовка плоских креплений сетчатки, заключается в том, что вся сосудистая сеть может быть выделена с большой четкостью.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что он технически сложен и его трудно выполнять последовательно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы изоляции сосудов трудно выучить только словами. Это очень ценный инструмент в любой лаборатории, которая проводит исследования биологии сосудов сетчатки, таких как некоторые заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, и эту технику продемонстрирует Джонатан Чоу, талантливый студент-медик из моей лаборатории.

После фиксации энуклеированного мышиного глаза и 10% нейтрального буферного формина в течение 24 часов поместите глаз в чашку Петри и залейте ее небольшим количеством воды. Начните рассечение с помощью ножниц для препарирования, чтобы аккуратно сделать первоначальный надрез на роговице. Затем, удерживая место разреза прямыми щипцами, с помощью ножниц разрежьте вдоль границы роговицы и склеры, удаляя роговицу.

Затем используйте тонкие, изогнутые и прямые щипцы. Медленно и осторожно отшелушить склеру и сосудистую оболочку от сетчатки в направлении зрительного нерва. Затем удалите хрусталик и излишки радужной оболочки и мусора с сетчатки, чтобы отделить нервные слои сетчатки от кровеносных сосудов.

Примерно на 500 микролитров 45 микрометров отфильтруйте воду в 24-луночный планшет и поместите сетчатку в лунку, затем осторожно встряхните в течение четырех-пяти часов при комнатной температуре, меняя воду каждые 30-60 минут. Продолжайте промывать сетчатку глаза в воде в течение ночи с легким встряхиванием При комнатной температуре на следующий день удалите воду и при 3% трипсина проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что в колодце не обнаружено мусора. Чтобы сосудистая сеть не прилипла к ней, инкубируйте ткань при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием или без него в течение одного-полутора часов.

Когда ткань начнет проявлять признаки распада, поместите пластину на предметный столик микроскопа, избегая сетчатки. Осторожно удалите трипсин, чтобы отделить сосудистую сеть. Сначала добавьте фильтрованную воду в сетчатку глаза с помощью щипцов.

Снимите внутреннюю ограничивающую мембрану, которая выглядит в виде тонкого прозрачного слоя. Встряхивайте тарелку при легком взбалтывании. Через пять минут снова поместите пластину на предметный столик микроскопа и осторожно замените воду, не допуская повреждения сетчатки, чтобы помочь освободить сеть сосудов от прилипшей ткани сетчатки.

Промойте сетчатку, как показано только что на рисунке, до тех пор, пока в воде не останется практически никакого мусора после последнего промывки. Поэтому, как правило, удаление всей несосудистой ткани является самой сложной частью процедуры. Следующие методы могут использоваться последовательно или по отдельности Чтобы облегчить выделение сосудистой сетки, одним из важных советов является погружение всех инструментов и трипсина перед манипуляциями с сетчаткой.

Это может помочь избежать прилипания салфетки к оборудованию. Нанесите на наконечник микропипетки объемом 200 микролитров зарезервированный трипсин, а затем осторожно наведите пипетку вверх и вниз, рядом с сосудами сетчатки и дуя в их направлении, вызывая легкое возбуждение. Если несосудистая ткань все еще является резистентным центром, микропипетку, покрытую трипсином, направьте наконечник зрительного нерва и тщательно проведите пипетку по всей сети сосудов вверх и вниз, чтобы помочь разрушить несосудистую ткань.

Наконец, хорошо. С помощью щипцов можно аккуратно поднять сосудистую сеть из воды, чтобы вытеснить любые несосудистые компоненты. Конечным результатом должна быть неповрежденная сосудистая сеть сетчатки, свободная от мусора.

Чтобы визуализировать сосудистую систему, сначала капните каплю воды на чистое предметное стекло. Затем переваренные сосуды перегруженные сосуды перегружены в воду под контролем осциллографа. Если крепление закрылка VA сложено или разложено, сложенные сосуды приводят к плохой видимости.

При окрашивании, если ткань сложена, добавьте немного воды и аккуратно встряхните предметное стекло, чтобы облегчить разворачивание. Затем с помощью микропипетки медленно удалите лишнюю воду. Конечным результатом успешной процедуры является плоское крепление всей сети сосудистой сети сетчатки мыши с сохранением архитектуры и окрашиванием гематом, тоином и эоином.

Как показано здесь, как видно на этом изображении, в сетчатке может наблюдаться четкая дифференциация между эндотелиальными клетками и перицитами. Ядра эндотелиальных клеток, как указано белой стрелкой, имеют овальную или удлиненную форму и полностью лежат внутри стенки сосуда. Ядра паразита обозначены черной стрелкой мелкие, шарообразно окрашены густо и в целом имеют выпуклое положение вдоль стенки капилляра.

Трипсин и переваривание — это распространенная процедура, используемая для анализа сосудистой патологии на животных моделях с диабетом. На этом изображении показан пример капиллярной дегенерации, обозначенной белой стрелкой, наблюдаемой у мыши DB DB, модели диабета второго типа. Хотя эта процедура была оптимизирована для сетчатки мыши, аналогичные результаты могут быть получены и на сетчатке крыс.

Важно отметить, что сетчатка крысы, как показано на этих изображениях, больше, чем сетчатка мыши, и требует 12, а не 24 пластины. Сосудистая сеть сетчатки крысы также менее хрупка, чем у мышиного аналога. Крайне важно удалить как можно больше несосудистой ткани.

Любые остатки приведут к неспецифическому окрашиванию и приведут к плохой визуализации сосудистой сети. На этом изображении, например, можно наблюдать неудачное удаление всей несосудистой ткани. Кроме того, важно, чтобы сетчатка была развернута при монтаже, чтобы улучшить визуализацию сосудистой сети.

На этом изображении видно неудачное разворачивание сосудистого плоского крепления. После освоения этой технически сложной процедуры. Трипы и дайджесты могут быть чрезвычайно ценным методом, позволяющим детально визуализировать всю сосудистую сеть.

Улучшив эту технику на мышином глазу, исследователи могут использовать генетически модифицированных мышей для изучения различных путей, которые могут взять под контроль сосудистую сеть сетчатки и позволить нам понять патофизиологию различных заболеваний сетчатки. В результате этого мы можем улучшить наше понимание таких патологических заболеваний, как диабетическая ретинопатия. Изучение моделей мышей, таких как мышь DVDB, может в конечном итоге дать возможность найти новые потенциальные терапевтические вмешательства, нацеленные на сосудистую сеть сетчатки.