Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией

Данная процедура включает колонизацию носоглотки мыши с помощью streptococcus pneumonia с последующим выделением колонизировавших бактерий, а также адгезивных или привлеченных клеток. Это достигается путем предварительного приготовления бактериального инокулята интересующего штамма S pneumonia.

Затем живые бактерии вводят интраназально анестезированным мышам, находящимся в фиксаторе. После достижения желаемого периода колонизации мышей подвергают эвтаназии и проводят промывание носовых ходов путем канюлирования обнаженной трахеи и вымывания содержимого через нос. Количество бактерий в носовых промывных водах можно определить с помощью микробиологических методов. В качестве альтернативы иммунный ответ можно оценивать с помощью методов проточной цитометрии для фенотипирования привлеченных клеток или с помощью количественной ПЦР.

Для измерения уровней экспрессии интересующей мРНК перед началом работы вам потребуется подготовить фиксаторы для мышей для этапа интраназальной колонизации и канюлированные иглы для назального промывания. Фиксатор для мыши можно изготовить простым путем отрезания конусообразного кончика пробирки типа «Falcon» объемом 50 мл. После создания отверстия обязательно зашлифуйте острые края с помощью ножниц.

Для подготовки канюлированных игл вам понадобятся следующие материалы: полиэтилентрубки PE 20 с внутренним диаметром 0,38 мм, шприц объемом 1 мл с надетыми на него кососрезанными иглами калибра 26 и 3/8, пара острых тонких ирисных ножниц и пинцет. Разрежьте трубку PE 20 тонкими ножницами на фрагменты длиной примерно 2,5 см (или один дюйм), следя за тем, чтобы каждый конец имел скос.

С помощью пинцета осторожно наденьте один из этих фрагментов на кончик иглы. Чтобы избежать повреждения трубки, канюлированные иглы можно хранить в 70% ethanol до момента использования, промывая их PBS непосредственно перед применением. Для интраназальной колонизации мышей S pmo рекомендуется использовать концентрацию 10⁹ КОЕ/мл в объеме 10 µL.

Для введения финальной дозы в 10⁷ КОЕ держите инокулят на льду до самого момента использования и обязательно перемешивайте его между каждой колонизацией. Помимо инокулята, вам также понадобятся дозаторы P10 или P20, стерильные наконечники для пипеток и фиксатор для мышей. Захватите отдельную мышь за хвост и зафиксируйте ее, поместив в предварительно подготовленный аппарат-фиксатор для мышей.

Если вам трудно направить мышь в фиксатор, может помочь его расположение перед мышью и чуть выше, чтобы животное могло заползти вверх. Когда мышь окажется внутри фиксатора, зафиксируйте её за основанием тела, осторожно подтолкнув вверх так, чтобы нос показался из конического конца фиксатора. С помощью пипетки P 10 или P 20 проведите инокуляцию каждой мыши, внеся 10 µL подготовленной культуры, равномерно распределив её между обеими ноздрями.

Позвольте инокуляту стекать в нос, постепенно пульсируя при введении, чтобы дать мыши достаточно времени для вдыхания инокулята. Ожидается, что мышь может частично вычихнуть инокулят из носа. Обратите внимание, что для этой процедуры мыши должны находиться под анестезией, чтобы бактерии оставались локализованными в носоглотке и не распространялись в нижние дыхательные пути.

Для целей данной демонстрации в качестве инокулята используется PBS, однако при работе с живыми бактериями обязательно соблюдайте утвержденные руководством института правила. Например, в большинстве учреждений колонизация должна проводиться в боксе II уровня биологической безопасности. Если в качестве метода мониторинга конечной точки используются индикаторы веса, то сразу после колонизации необходимо каждые 12–24 часа наблюдать за мышами на предмет появления клинических симптомов, включая вялость, взъерошенность шерсти и потерю веса.

После колонизации мышей содержите их в течение необходимого периода времени. По окончании этого периода мышей усыпляют и проводят промывание носовых ходов, так как цервикальная дислокация может привести к повреждению трахеи. Данного метода эвтаназии следует избегать.

Перед проведением промывания носовых ходов убедитесь, что у вас под рукой есть следующее: заранее подготовленные канюлированные иглы, 70% водный этанол, пинцет, пара острых тонких ирисных ножниц, фосфатно-солевой буферный раствор, буфер для лизиса РНК и микроцентрифужные пробирки объемом 1 мл. Когда вы будете готовы приступить, положите животное на спину и с помощью 70% водного этанола простерилизуйте шерсть в передней части тела, особенно в области шеи.

Следите за тем, чтобы этанол не попал в ноздри. Сделайте один продольный разрез по средней линии шеи животного, чтобы создать отверстие для визуализации трахеи. Осторожно раздвиньте кожу в стороны, обнажая ткани шеи.

На данном этапе трахея должна стать видимой, окруженная продольными мышцами с обеих сторон. Осторожно перережьте эти мышцы, чтобы обеспечить четкий обзор самой трахеи, стараясь не повредить окружающие сосуды. В случае случайного повреждения сосудов и появления крови в данной области, очистите ее перед тем, как продолжить.

Дождитесь прекращения кровотечения, затем несколько раз очистите область, поливая ее стерильным PBS и осторожно промакивая излишки влаги стерильной марлей. После того как трахея будет полностью обнажена, сделайте поперечный полулунный разрез в верхней части трахеи (примерно на половине ее высоты). Наберите стерильный PBS в канюлированный шприц.

Введите канюлю в трахею в направлении к носу, удерживая скошенный край направленным вниз для облегчения введения. После установки канюли поверните ее на 180 градусов и осторожно продвигайте вверх, пока не почувствуете легкое сопротивление. Поместите трубку EEND DPH, предназначенную для сбора образцов, непосредственно под нос мыши.

Проверьте правильность расположения канюли, введя минимальный объем промывной жидкости PBS. При правильном расположении канюли вокруг носоглотки (NAS) мыши должна образоваться капля жидкости. Если тестовый раствор PBS вытекает непосредственно изо рта животного, вытяните канюлю назад и установите её заново, осторожно продвигая вперед до появления легкого сопротивления.

Следите за тем, чтобы не проталкивать канюлю слишком далеко за точку этого сопротивления, иначе она пройдет сквозь носовое небо и окажется в ротовой полости. После подтверждения правильного положения канюли быстро введите 200 µL PBS, чтобы помочь вытеснить и собрать максимальное количество клеток. Содержимое должно вытекать через ноздри мыши в пробирку для сбора.

Немедленно поместите образец на лед. Эти образцы впоследствии могут быть использованы для анализа бактериальной нагрузки, а также клеточного рекрутирования. Для сбора образцов для анализа РНК используйте отдельную канюлированную иглу, содержащую 500 µL буфера для лизиса РНК, чтобы провести повторный назальный лаваж.

Обратите внимание, что буфер для лизиса РНК приведет к отслоению эпителия и разрушению окружающих тканей. Поэтому следует избегать контакта с такими органами, как легкие. Если для количественной оценки бактериальной нагрузки в носоглотке требуется сохранить эти ткани, вам понадобится следующее.

Пробирки Epicor, микробиологические чашки с триптиказно-соевым-яичным агаром, дополненным 5% кровью овцы. Вортекс, стерильные наконечники для пипеток с PBS, дозаторы P 20 и P 200. Сначала, работая в боксе II уровня биологической безопасности (BSL-2), подготовьте серию последовательных разведений для каждого образца назального лаважа мыши.

Как правило, ожидается, что концентрация S pneumoniae в носоглотке составляет от нуля до 10⁴ КОЕ. Поэтому проведите трехкратное десятикратное серийное разведение: добавьте 10 µL исходного образца промывания носа в первую пробирку до достижения концентрации 10⁻¹ КОЕ/мл и продолжайте разведение до получения трех образцов с избыточным разбавлением, тщательно перемешивая образцы на вортексе после каждого этапа разведения. Пожалуйста, обратите внимание, что данное видео приводится исключительно в демонстрационных целях.

Всегда следует придерживаться надлежащей лабораторной техники, включая замену наконечников пипеток при переходе между разведениями. С помощью маркера разделите вашу чашку Петри на квадранты и подпишите каждый квадрант соответствующим разведением, которое будет на него высеяно. Нанесите на агариковую среду по три капли образцов каждого разведения объемом 10 µL. Дайте им высохнуть в открытом виде в течение 15–30 минут, затем закройте чашки и поместите их перевернутыми в бактериологический инкубатор при оптимальных условиях для роста пневмококков, обычно при 37 °C и 5% CO2.

Инкубируйте эти планшеты от 24 до 48 часов. По истечении этого времени извлеките планшеты и определите количество колонизирующих бактерий, вычислив среднее число колоний, образовавшихся на планшете. Для каждого разведения колонии animo можно идентифицировать по их характерному бежевому цвету и зонам альфа-гемолиза, которые представляют собой небольшие ореолы вокруг каждой колонии, возникающие в результате расщепления бактериями добавок крови в агаре.

И, наконец, по небольшим углублениям в центре каждой колонии, которые придают ей вид эритроцита. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как установить назофарингеальную колонизацию у мыши, как изолировать бактерии и клетки из носоглотки мыши после колонизации с помощью назального промывания и как количественно определить соответствующую бактериальную нагрузку, используя микробиологические методы. Мы надеемся, что методы, описанные в этом видео, побудят вас использовать интраназальную модель колонизации для изучения ответов хозяина на патогены в контексте этого недостаточно изученного региона.