Характеристика воспалительных реакций во время интраназальной колонизации стрептококковой пневмонией

Эта процедура включает в себя колонизацию носоглотки стрептококковой пневмонией и последующее извлечение колонизирующих бактерий, а также адгезивных или рекрутированных клеток. Это достигается путем предварительного приготовления бактериального инокулята от S. pneumonia. Штамм интереса.

После желаемой продолжительности колонизации мышей усыпляют и проводят промывание носа путем канюляции их открытых трахей и вымывания содержимого через нос. Количество бактерий, присутствующих в носовых лаважах, может быть количественно определено с помощью микробиологических методов. В качестве альтернативы иммунные ответы могут быть проанализированы с использованием методов проточной цитометрии для фенотипа рекрутированных клеток или количественных методов ПЦР.

Чтобы измерить интересующие вас уровни экспрессированной мРНК до начала процедуры, вам необходимо подготовить ограничители для интраназальной колонизации и канюлированные иглы для промывания носа. Удерживатель для мыши можно приготовить, просто отрезав конический кончик трубки от сокола объемом 50 миллилитров. После того, как вы создали отверстие, обязательно используйте ножницы, чтобы отполировать острые концы.

Для приготовления канюлированных игл вам понадобится следующая полиэтиленовая трубка PE 20 с внутренним диаметром 0,38 миллиметра. Один мил шприц ограничен 26 и тремя иглами восьмого калибра со скошенными углом, парой острых, тонких ирисов, ножницами и парой щипцов. Разрежьте трубку PE 20 тонкими ножницами на кусочки примерно 2,5 сантиметра или один дюйм в длину, следя за тем, чтобы каждый конец имел скошенный кончик.

С помощью щипцов осторожно наденьте один из этих кусочков на кончик иглы. Чтобы избежать прокола со стороны трубки, канюлированные иглы можно хранить в 70% этаноле до тех пор, пока это не понадобится, и промывать PBS непосредственно перед использованием. Для интраназальной колонизации мышей с помощью S pmo мы рекомендуем использовать концентрацию от 10 до девяти колониеобразующих единиц на мил в 10 микролитрах.

Для получения окончательной дозы от 10 до 7 КОЕ держите инокулюм на льду непосредственно перед использованием и обязательно перемешивайте между каждой колонизацией. В дополнение к инокуляту вам также понадобятся стерилизованные наконечники пипеток P 10 или P 20 и удерживатель для мыши. Изолируйте отдельную мышь за хвост и ограничьте ее, поместив в заранее подготовленный удерживающий аппарат для мыши.

Если у вас возникли проблемы с направлением мыши в удерживающее устройство, может быть полезно расположить ее спереди и над мышью, позволяя животному ползти вверх. Как только мышь окажется внутри ограничителя, закрепите его за основание тела, осторожно подталкивая вверх так, чтобы ее носик высовывался из сужающегося конца ограничителя. С помощью пипетки P 10 или P 20 инокулируйте каждую мышь, внеся 10 микролитров приготовленной культуры, равномерно распределив ее между обеими. Ноздри.

Дайте инокулянду капнуть в нос, пульсируя инокуляцией постепенно, уделяя мышке время, необходимое для вдыхания инокулянта. Мышь может чихнуть из носа, что вполне ожидаемо. Обратите внимание, что мыши должны быть обезболены для этой процедуры, чтобы бактерии оставались локализованными в носоглотке и не распространялись на нижние дыхательные пути.

Для целей этой демонстрации мы вводим инокуляцию PBS, но при работе с живыми бактериями обязательно проводите процедуру в соответствии с утвержденными институтом рекомендациями. Например, большинство учреждений потребуют, чтобы колонизация проводилась в условиях второго уровня биобезопасности. Если вы используете индикаторы веса как часть вашего способа мониторинга конечных точек, MA сразу после колонизации, наблюдайте за мышами каждые 12–24 часа на предмет клинических симптомов, включая вялость, взъерошенную шерсть и потерю веса.

Как только мыши будут колонизированы, держите их в течение желаемого периода времени. В конце этого периода мышей усыпляют и проводят промывание носа, так как вывих шейки матки может потенциально повредить трахею. Этого метода эвтаназии необходимо избегать.

Перед проведением промывания носа убедитесь, что у вас под рукой есть следующее. Предварительно подготовленные канюлированные иглы, 70% водный этанол, пара щипцов, пара острых ножниц с тонкой радужной оболочкой, фосфат, буферный физиологический раствор, буфер для лизиса РНК и одна мил-эйнорская трубка. Как только вы будете готовы начать, разложите животное на спине и с помощью 70% водного этанола простерилизуйте переднюю часть его шерсти, особенно область шеи.

Меры предосторожности для предотвращения попадания этанола в ноздри. Сделайте один продольный разрез по средней линии шеи животного, позволив себе создать отверстие для представления трахеи. Осторожно отклейте кожу с обеих сторон, обнажив ткани шеи под ней.

В этот момент трахея должна быть видна, окруженная продольными мышцами с обеих сторон. Аккуратно обрежьте их, чтобы обеспечить четкий обзор самой трахеи, стараясь не разорвать окружающие сосудистые сосуды. В случае, если вы случайно перерезали, сосудистая сеть и кровь присутствуют в этой области до того, как вы продолжите.

Дайте кровотечению остановиться, а затем очистите область несколько раз, дозируя стерильный PBS и используя стерильную марлю, чтобы аккуратно впитать лишнюю влагу. Как только трахея будет должным образом обнажена, сделайте поперечный полулунный надрез в трахее примерно на полпути вверх. Капните стерильный PBS в канюлированный шприц.

Вставьте канюлю в трахею по направлению к носу, сохраняя скошенный край направленным вниз для удобства введения. Как только канюля будет на месте, поверните ее на 180 градусов и осторожно прощупывайте вверх, пока не почувствуете сопротивление света. Поместите трубку EEND DPH, предназначенную для сбора проб, прямо под нос мыши.

Проверьте правильность установки канюли, выдав минимальное количество жидкости для промывания PBS. После этого вокруг NAS мыши должна образоваться капля жидкости, если канюля размещена правильно. Если тестовый PBS выходит непосредственно изо рта животного, оттяните канюлю назад и снова переместите ее, осторожно прощупывая вперед, пока не почувствуете очень небольшое сопротивление.

Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть канюлю слишком далеко за пределы этого сопротивления, так как вы продвинете ее мимо носового нёба к ротовой полости. После того, как вы убедитесь, что канюля расположена правильно, быстро введите 200 микролитров PBS, чтобы помочь переместить и собрать максимальное количество клеток. Содержимое должно вытекать через ноздри мыши и попадать в трубку для сбора.

Поместите образец сразу на лед. Эти образцы могут быть впоследствии проанализированы на бактериальную нагрузку, а также на клеточный рекрутинг. Для сбора образцов для анализа РНК используется отдельная канюлированная игла, содержащая 500 микролитров буфера для лизиса РНК, для проведения вторичного промывания носа.

Обратите внимание, что буфер для лизиса РНК обнажает эпителий и разрушает окружающие ткани. Поэтому необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать контакта с такими органами, как легкие. Если ретенция этих тканей желательна для количественного определения бактериальной нагрузки в носоглотке, вам потребуется следующее.

Пробирки Эпикор, микробиологические планшеты, содержащие триптих соевого яйца, дополнены 5% овечьей крови. Вихревой смеситель, стерильные наконечники для пипеток PBS и пипетки P 20 и P 200. Сначала работая в BSL с двумя капюшонами, подготовьте серию серийного разведения для каждого образца назального лаважа мирина.

В целом, можно ожидать, что концентрации S. pneumoniae в носоглотке будут составлять от нуля до 10 на четыре КОЕ. Поэтому проведите три десятикратных последовательных разведения, добавьте 10 микролитров аккуратного образца для промывания носа в первую пробирку до концентрации 10 до минус одного КОЕ на милл и продолжайте уменьшать до тех пор, пока не разбавите три образца чрезмерно тщательно вихревыми между каждым разведением. Обратите внимание, что данное видео носит исключительно демонстративный характер.

Всегда следует придерживаться правильной лабораторной техники, включая замену наконечников пипетки между дилу. Используя острый наконечник, разделите его обратно на логическую пластину на квадранты и пометьте квадранты соответствующим разбавлением, которое будет нанесено на него. Вылейте три капли по 10 микролитров образцов каждого разбавления на агаровую пластину. Дайте им высохнуть в течение 15-30 минут без крышки, затем накройте тарелки и поместите вверх дном в бактериальный инкубатор с оптимальными условиями для роста пневмококковой инфекции, обычно 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

Инкубируйте эти пластины от 24 до 48 часов. По истечении этого промежутка времени снимите пластины и определите количество колонизирующих бактерий путем усреднения колоний, образовавшихся на пластине. Для каждого разведения колонии анимо могут быть идентифицированы по их характерному бежевому цвету, их зонам альфа-гемолиза, которые представляют собой небольшие ореолы вокруг каждой колонии, созданные в результате бактериального переваривания кровяной добавки в агаре.

И, наконец, небольшими углублениями в центре каждой колонии, которые придают ей вид эритроцита. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как установить носоглотку es pmo, колонизацию у мыши, как выделить бактерии и клетки из носоглотки мыши после колонизации с помощью промывания носа и как количественно оценить соответствующую бактериальную нагрузку с помощью микробиологических методов. Мы надеемся, что методы, описанные в этом видео, побудят вас использовать интраназальную модель колонизации для изучения реакции хозяина на патогены в контексте этой малоизученной области.