Определение допустимого жирные кислоты и концентрации токсина холеры с использованием человеческих клеток эпителия кишечника и BALB / C макрофаги мыши

Общая цель данной процедуры заключается в определении допустимых концентраций жирных кислот и холерного токсина, которые не оказывают негативного влияния на выживаемость клеток. Для этого сначала выращивают соответствующий тип клеток. На втором этапе клетки инкубируют с различными концентрациями трех тестируемых жирных кислот или с холерным токсином.

Через 24 часа оценивают выживаемость клеток с помощью МТТ-теста. В конечном итоге данные спектрометрии, полученные в результате МТТ-теста, позволяют определить оптимальные концентрации жирных кислот и холерного токсина, при которых обработка клеток не приводит к значительному снижению их выживаемости. Значимость данного метода заключается в возможности предотвращения холерных инфекций, поскольку вакцинация не всегда оказывается эффективной.

Макрофаги *Mus musculus* от мышей линии bowel C будут использоваться для всех определений ко-токсинов, а для определения концентрации жирных кислот в более крупном масштабе клетки культивируют в одной из двух сред: DMEM с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотика-антимикотика, или базовой средой RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% L-глутамина и 1% антибиотика-антимикотика. Согласно данному протоколу, клетки bowel C выращивают в квадратных флаконах Corning объемом 75 см² с вентилируемыми крышками при 37 °C, 95% воздуха и 5% диоксида углерода. Для прецизионного определения концентрации жирных кислот используют эпителиальные клетки кишечника человека, культивируемые в квадратных флаконах Corning объемом 75 см² с вентилируемыми крышками в среде HyperCare, дополненной 10% FBS и 30 ng/mL.

Для Human EGF не используйте антибиотиков и антимикотических реагентов; согласно инструкциям производителя, инкубируйте при 37 °C, 95% воздуха и 5% углекислого газа. Пересевайте все клетки в соотношении от 1:3 при достижении примерно 70% конфлюэнтности, в зависимости от типа клеток; обычно пересев клеток проводят каждые два-пять дней до начала обработки жирными кислотами. Сначала подготовьте жирные кислоты: перенесите олеиновую, линолевую и линолевую кислоты из предоставленных компанией стеклянных ампул в стерильные стеклянные флаконы. Затем перенесите каждую жирную кислоту в отдельную стерильную пробирку типа Eppendorf.

Растворите каждую жирную кислоту в 100% Ethanol в разведении 1:6, после чего добавьте неполную среду RPMI 1640 до конечной концентрации 10 micrograms per microliter. Перемешайте каждый раствор на вортексе и перенесите их в стеклянные флаконы для хранения в морозильной камере при температуре minus 20 degrees Celsius.

Рассейте эпителиальные клетки кишечника человека из расчета 2 500 клеток на лунку в 96-луночные планшеты для культивирования тканей, затем добавьте соответствующую полную среду, чтобы довести общий объем в каждой лунке до 200 µL. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 95% воздуха и 5% CO2 в течение 24 часов.

По истечении 24-часового периода пролиферации удалите среду. В лунки, предназначенные для положительного контроля, добавьте соответствующие концентрации каждой тестируемой жирной кислоты. В качестве отрицательного контроля инкубируйте клетки в полной среде, а также инкубируйте клетки в 70% ethanol.

После этого добавьте полную среду, чтобы довести общий объем в каждой лунке до 200 microliters. Инкубируйте обработанные планшеты в течение 24 часов перед началом МТТ-теста. Для подготовки холерного токсина для обработки клеток растворите холерный токсин в PBS до концентрации one milligram per milliliter.

Разлейте раствор по криопробиркам и храните при температуре от 2 до 8 °C до начала обработки клеток. Разведите токсин в соотношении 1:100 в стерильном PBS или неполном DMEM для получения конечной рабочей концентрации 1 ng/µL на лунку. Расселите макрофаги в 96-луночный планшет из расчета 2 500 клеток на лунку.

Планшеты для культивирования тканей с лунками инкубируют при 37 °C в атмосфере с 95% воздуха и 5% углекислого газа в течение 24 часов. После 24-часового периода пролиферации среду удаляют, и в лунки добавляют соответствующую тестовую концентрацию холерного токсина. Аналогично обработке жирными кислотами, для всех образцов и вариантов обработки инкубируют клетки в полной среде в качестве положительного контроля и в 70% этаноле в качестве отрицательного контроля.

Используйте не менее трех повторностей, при этом для положительных контролей количество повторностей должно быть больше. Добавьте полную среду, чтобы довести общий объем в каждой лунке до 200 µL. Инкубируйте планшеты, обработанные холерным токсином, в течение 24 часов перед началом МТТ-теста.

Через 24 часа после обработки клеток жирными кислотами или color toin жизнеспособность клеток определяют с помощью МТТ-теста. Удалите раствор из каждой лунки 96-луночного планшета, предназначенного для анализа, и замените его 200 µL свежим полным питательным раствором.

Добавьте по 10 µL свежеприготовленного раствора MTT с концентрацией 2,5 mg/mL в каждую лунку. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение трех-четырех часов. По истечении трех-четырех часов удалите среду и добавьте по 100 µL 0,04 M раствора соляной кислоты в изопропаноле в каждую лунку.

Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем перенесите раствор из каждой лунки в центрифужную пробирку и центрифугируйте при 20 000 ×g в течение одной минуты или до образования осадка. Перенесите от 20 до 40 µL каждого образца в планшетный ридер и измерьте оптическую плотность при 570 нм с помощью спектрофотометра.

На этом рисунке показана выживаемость большинства макрофагов в зависимости от положительного контроля при обработке возрастающими концентрациями олеиновой, линолевой и линолевых кислот. Очевидно, что клетки не переносят концентрации выше 100 nanograms per microliter для любой из жирных кислот. Эксперимент был повторен с использованием эпителиальных клеток человека для концентраций ниже 100 nanograms per microliter с шагом 10 nanogram per microliter до 70 nanograms per microliter.

На данном графике показана выживаемость клеток при каждой концентрации олеиновой кислоты. Метод однофакторного анализа (One-way ANOVA) указал на статистически значимое различие одного или нескольких средних значений. Однако только при воздействии более высоких концентраций средние значения статистически значимо отличались от показателей положительного контроля.

Интересно, что наблюдаемые различия были обусловлены повышением жизнеспособности клеток при большей вариабельности. Аналогичные результаты были получены для линолевой и линолевой кислот. Один из способов.

Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) показал, что ни одно из средних значений в опытных группах статистически не отличалось от среднего значения положительного контроля, однако для некоторых более высоких концентраций, таких как 60 нг/мкл линолевой кислоты, наблюдается тенденция к увеличению вариабельности. Судя по этим результатам, оптимальные концентрации жирных кислот при использовании эпителиальных клеток кишечника человека находятся в диапазоне от 1 до 5 нг/мкл. Также были изучены эффекты различных концентраций холерного токсина на выживаемость большинства макрофагов, при этом уровни токсина в опытных группах варьировались с относительно большим шагом.

Наблюдалась тенденция к снижению жизнеспособности клеток, как и ожидалось, поскольку показатели выживаемости существенно различались для каждого варианта обработки. Высокая вариабельность жизнеспособности привела к отсутствию статистически значимых различий между средним значением положительного контроля и любым из вариантов обработки, что обусловило необходимость дальнейшего тестирования при уровнях токсина 100 nanograms или ниже. На данном графике показана жизнеспособность клеток при использовании более низких концентраций токсина.

Жизнеспособность клеток сильно варьирует почти для всех концентраций токсина, хотя в результате обработок наблюдалось небольшое повышение жизнеспособности. Эти увеличения не являются статистически значимыми для любой из обработок по сравнению со средним значением положительного контроля. На основании этих результатов.

Рекомендуемая концентрация холерного токсина составляет менее 30 нг на одну обработку при использовании макрофагов мышей линии bowel C после их культивирования. Данный метод открыл исследователям в области изучения холеры путь к изучению того, могут ли жирные кислоты усилить иммунитет против инфекции, вызываемой V. cholerae.