Чувствительным методом для количественной стареющие клетки рака

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы быстро и с высокой чувствительностью количественно оценить старение клеток. В данной работе мы демонстрируем полезность этого метода в скрининге потенциальных химиотерапевтических препаратов. Во-первых, вызывает клеточное старение.

Химиотерапевтический препарат доксорубицин добавляется в раковые клетки. Затем применяется Bain A one для нейтрализации кислого pH клеточных лизосом. Затем при поглощении клетками добавляют бета-галактический субстрат C 12 FDG.

C 12 FDG гидролизуется и флуоресцирует. Поскольку бета GCSE обогащен лизосомами стареющих клеток, они становятся более флуоресцентными, чем нестареющие клетки. Для количественной оценки разницы во флуоресценции клетки запускают с помощью проточного цитометра. Анализ полученных данных позволяет количественно оценить процент стареющих раковых клеток при различных условиях лечения.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как бета-галактоза, заключается в том, что он способствует быстрому и чувствительному количественному определению стареющих клеток. На самом деле, мы впервые добавили идею этого метода, когда столкнулись с трудностями с количественной оценкой стареющих клеток с помощью широко используемой бета-галактозы. Хотя мы используем этот метод для обнаружения старения раковых клеток, он также может быть использован на нормальных клетках.

Этот метод может помочь ответить на быстрые вопросы в области рака, например, вызывает ли химиотерапевтический препарат раковые клетки SSE, что может способствовать развитию злокачественных новообразований. Таким образом, этот метод может в конечном итоге помочь уведомить о новых терапевтических методах лечения рака. Работая в химическом вытяжном шкафу, порошок C 12 FDG растворяют в ДМСО до конечной концентрации 20 миллимолярных аликвот в 0,5 миллилитровых эйноровых пробирках и хранят при температуре минус 80 градусов Цельсия.

ДМСО следует использовать с соответствующими условиями безопасности, также растворять. CIN A один порошок в ДМСО до конечной концентрации 0,1. Миллимоляр Элоква разложите раствор в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 миллилитра и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Обратите внимание, что CIN следует использовать с соответствующими мерами предосторожности. Эта процедура может быть выполнена с использованием как адгезивных, так и неадгезивных клеток. Здесь процедура продемонстрирована с использованием клеточной линии миеломы человека RPMI 8 2 2 6.

Эти клетки выращивают в суспензии, культивируют RPMI 8 2 2 6 клеток в среде, содержащей 10% FBS и 1% антибиотиков при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, за 24 часа до проведения эксперимента засеивают клетки в шести луночных планшетах так, чтобы они находились в логарифмической фазе кривой клеточной пролиферации. На момент проведения эксперимента для определения процента стареющих клеток потребуется три образца клеток. Необработанные и не окрашенные ST клетки, необработанные клетки, окрашенные C 12 FDG, и обработанные клетки, окрашенные C 12 FTG.

Для каждого состояния требуется минимум пять умножить на 10 до пятой клетки, чтобы проточная цитометрия вызвала старение раковых клеток. При добавлении химиотерапевтического препарата доксорубицина концентрация препарата и продолжительность лечения должны быть адаптированы к типу клеток. Протестировано на rpmi 8 2 2 6 ячеек.

Старение может быть вызвано обработкой 10-й из шести клеток на миллилитр 15 наномолярным доксорубицином в течение 48 часов. Не забудьте включить необработанный образец в качестве отрицательного контроля, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Лечение химиотерапевтическими препаратами может привести к апоптозу клеток.

Поэтому через двое суток проверяют жизнеспособность клеток методом исключения трианового синего с помощью гемо, цитометра и микроскопа. Если процент жизнеспособности составляет менее 70%, удалите мертвые клетки с помощью соответствующего набора, такого как набор для удаления мертвых клеток от Milton E, чтобы гарантировать, что мертвые клетки не повлияют на последующий анализ. В противном случае удалите питательную среду, вращая клетки при давлении 300 GS в течение пяти минут.

Затем после удаления надосадочной жидкости в среде предварительной прогревания свежей культуры, содержащей 100 анома или цина, А для нейтрализации кислого рН лизосом инкубируют в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа растворяют бета-галакту субстрата С 12 FDG в довоенной свежей культуре. Средняя и конечная концентрация двух миллимоляров. После инкубации с бейлем мицином.

Добавьте C 12 FDG непосредственно в клетки и спитайте до конечной концентрации 33. Микромоляры инкубируются в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. После инкубации центрифугируйте клетки при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После отжима дважды промойте ячейки PBS, каждый раз отжимая вниз, как и раньше, и удаляя надосадочную жидкость после второй промывки. Резус суспендирует клеточную гранулу в 500 микролитрах холодного PBS, а затем выполняет коиммунологическое мечение для дальнейшей характеристики популяции стареющих клеток. Если у вас нет опыта проведения проточной цитометрии, самым сложным аспектом этой процедуры будет выполнение анализа проточной цитометрии.

Чтобы обеспечить успех, обязательно включите соответствующие элементы управления и при необходимости обратитесь за помощью к неопытному человеку. Перед запуском первого образца подготовьте двухпараметрическую графику, отображающую прямой канал рассеяния или FSC в сравнении с боковым каналом рассеяния SSC. Затем запустите первый образец, содержащий неразмеченные ячейки.

Установите фотоумножители или ФЭУ и определите область интереса, исключив мертвые клетки и клеточный мусор, которые могли появиться во время затвора для подготовки образца. Эта область представляет интерес на гистограмме с одним параметром, отображающей флуоресценцию C 12 FDG как FL единицу на логарифмической шкале оси x и количество событий по оси Y. Общее количество событий представляет собой количество проанализированных ячеек.

Установите ФЭУ таким образом, чтобы непомеченные ячейки появлялись в первой декаде на логарифмической шкале оси x. При необходимости определите автофлуоресценцию клеток, запустив немеченые клетки в поток. Цитометр запускает вторую выборку, содержащую необработанные клетки, по одному параметру гистограмму с отображением FL, один помещает курсор после тускло размеченной популяции.

Этот порог позволит проводить различие между нестареющими клетками, которые имеют тусклую метку, и стареющими клетками, которые ярко помечены. Запустите третий образец, содержащий обработанные клетки. Ярко помеченные стареющие клетки появляются выше порога, определенного на предыдущем этапе.

Оцените процент стареющих клеток, разделив количество ярких событий на общее количество событий, если это необходимо. Активность бета-галактотазы также может быть оценена с использованием средней интенсивности флуоресценции для оценки старения, вызванного химиотерапевтической процедурой. Коммерчески доступную клеточную линию множественной миеломы R RRP I 8 2 2 6 в течение двух дней обрабатывали доксорубицином, химиотерапевтическим препаратом и анализом на старение, как описано в этом видео, эти гистограммы показывают флуоресценцию необработанных клеток слева и обработанных клеток справа.

Популяция ярко помеченных клеток, представляющих стареющие клетки, появляется в области V.In параллель, тот же образец клетки был окрашен с помощью анализа бета-галакто-сасе. На этом репрезентативном рисунке показаны полностью голубые и частично голубые клетки, чтобы проиллюстрировать сложность различения истинно голубых стареющих клеток. Чтобы проиллюстрировать специфичность C12 FDG при определении процента стареющих клеток, клетки также обрабатывали различными концентрациями доксорубицина.

Процент стареющих клеток определяли путем деления числа ярких событий. По общему числу событий процент стареющих клеток составил 0,8%, 15,78% и 26,31% для дозы 5, 25 и 50 наномолярных доксорубицинов соответственно. Это демонстрирует, что мечение C 12 FTG специфично для стареющих клеток.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как количественно определить стареющие клетки, могут ли они рядиться или не могут быть серийно использованы с помощью проточной цитометрии, следуя этой процедуре таких методов, как иммуномаркировка, чтобы охарактеризовать стареющие клетки. Не забывайте, что работа с ДМСО или раковыми клетками может быть чрезвычайно опасной. Во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.