Чувствительным методом для количественной стареющие клетки рака

Общая цель данной процедуры заключается в быстром и чувствительном количественном определении клеточного старения. Здесь мы демонстрируем полезность этого метода при скрининге потенциальных химиотерапевтических препаратов. Сначала необходимо индуцировать клеточное старение.

К раковым клеткам добавляют химиотерапевтический препарат доксорубицин. Затем применяют Bain A one для нейтрализации кислого pH клеточных лизосом. После этого добавляют проникающий в клетку субстрат бета-галактозидазы C 12 FDG, который поглощается клетками.

C 12 FDG подвергается гидролизу и начинает флуоресцировать. Поскольку бета-глюкуронидаза (beta GCSEs) обогащена в лизосомах стареющих клеток, они становятся более флуоресцентными, чем нестареющие клетки. Для количественного определения разницы в интенсивности флуоресценции клетки анализируют с помощью проточного цитометра; анализ полученных данных позволяет количественно определить процент стареющих раковых клеток при различных условиях лечения.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как анализ на бета-галактозидазу, является обеспечение быстрого и чувствительного количественного определения сенесцентных клеток. Идея этого метода возникла у нас именно тогда, когда мы столкнулись с трудностями при количественном определении сенесцентных клеток с помощью широко используемого анализа на бета-галактозидазу. Хотя мы применяем данную методику для обнаружения сенесцентности в раковых клетках, она также может быть использована для нормальных клеток.

Данный метод позволяет оперативно ответить на вопросы в области онкологии, например, индуцирует ли химиотерапевтический препарат процесс sse в раковых клетках, что может способствовать злокачественному перерождению. Таким образом, эта методика в конечном итоге может помочь в разработке новых методов терапии рака. Работая в вытяжном шкафу, растворите порошок C 12 FDG в DMSO до конечной концентрации 20 millimolar, разлейте по пробиркам einor объемом 0.5 milliliter и храните при температуре minus 80 degrees Celsius.

ДМСО следует использовать с соблюдением соответствующих мер безопасности; также растворите порошок CIN A в ДМСО до конечной концентрации 0,1 мМ. Разлейте раствор в микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл и храните их при температуре -20 °C.

Примечание: при использовании CIN необходимо соблюдать соответствующие меры предосторожности. Данную процедуру можно проводить как с адгезивными, так и с неадгезивными клетками. В данном примере процедура продемонстрирована на линии клеток миеломы человека RPMI 8 2 2 6.

Данные клетки растут в суспензии; культивируйте клетки RPMI 8 2 2 6 в среде, содержащей 10% FBS и 1% антибиотиков, при 37 degrees Celsius и 5% carbon dioxide. За 24 часа до начала эксперимента посейте клетки в шестилуночные планшеты таким образом, чтобы к моменту анализа они находились в логарифмической фазе кривой клеточной пролиферации. Для определения процента сенесцентных клеток в ходе эксперимента потребуются три образца клеток: необработанные клетки без окрашивания ST, необработанные клетки, окрашенные C 12 FDG, и обработанные клетки, окрашенные C 12 FTG.

Для каждого условия для проведения проточного цитометрического анализа индуцированного старения раковых клеток требуется минимум 5 × 10⁵ клеток. При добавлении химиотерапевтического препарата доксорубицина концентрацию препарата и продолжительность обработки следует адаптировать в зависимости от типа клеток. Проверено на клетках rpmi 8 2 2 6.

Старение можно индуцировать, обрабатывая $10^6$ клеток на мл 15 нМ доксорубицином в течение 48 часов. Не забудьте включить необработанный образец в качестве отрицательного контроля; инкубируйте при 37 °C и 5% CO2. Обработка химиотерапевтическими препаратами может привести к апоптозу клеток.

Следовательно, через два дня проверьте жизнеспособность клеток методом исключения трипанового синего с помощью гемоцитометра и микроскопа. Если процент жизнеспособности составляет менее 70%, удалите погибшие клетки с помощью соответствующего набора, например, dead cell removal kit от Milton E, чтобы погибшие клетки не исказили результаты последующего анализа. В противном случае удалите культуральную среду, осадив клетки центрифугированием при 300 g в течение пяти минут.

Затем, после удаления супернатанта, предварительно прогрейте свежую культуральную среду, содержащую 100 nM цитракона, для нейтрализации кислотного pH лизосом; инкубируйте в течение одного часа при 37 °C и 5% CO2. Растворите субстрат бета-галактозидазы C12FDG в предварительно прогретой свежей культуральной среде до конечной концентрации 2 mM. Проведите инкубацию с бейламицином.

Добавьте C 12 FDG непосредственно к клеткам и среде до конечной концентрации 33 µM; инкубируйте в течение двух часов при 37 °C и 5% CO2. После инкубации центрифугируйте клетки при 300 ×g в течение пяти минут при 4 °C.

После центрифугирования дважды промойте клетки раствором PBS, каждый раз осаждая их центрифугированием, как и ранее, и удалив супернатант после второго промывания. Ресуспендируйте клеточный осадок в 500 µL холодного PBS, затем проведите совместное иммуномаркирование для дальнейшей характеристики популяции сенесцентных клеток. Если у вас нет опыта работы с проточной цитометрией, наиболее сложным этапом данной процедуры будет выполнение анализа методом проточной цитометрии.

Для обеспечения успешного результата обязательно включите соответствующие контроли и при необходимости обратитесь за помощью к опытному специалисту. Перед анализом первого образца настройте двухпараметрический график, отображающий прямой свет (канал FSC) относительно бокового рассеяния (канал SSC). Затем проанализируйте первый образец, содержащий немаркированные клетки.

Настройте фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и определите область анализа (ROI), исключив мертвые клетки и клеточный дебрис, которые могли появиться на этапе подготовки образца (гейтирование). Эта область анализа представляет собой однопараметрическую гистограмму, где по логарифмической шкале оси X отображается флуоресценция C 12 FDG как FL1, а по оси Y — количество событий. Общее количество событий соответствует числу проанализированных клеток.

Настройте ФЭУ таким образом, чтобы немеченые клетки находились в первом десятичном интервале логарифмической шкалы по оси x. При необходимости определите уровень автофлуоресценции клеток, пропустив немеченые клетки через проточный цитометр. Проанализируйте второй образец, содержащий необработанные клетки, используя однопараметрическую гистограмму с отображением FL1; установите курсор после популяции с низкой интенсивностью метки.

Данный порог позволит дифференцировать слабоокрашенные несенильные клетки и яркоокрашенные сенильные клетки. Проанализируйте третий образец, содержащий обработанные клетки. Яркоокрашенные сенильные клетки будут находиться выше порога, определенного на предыдущем этапе.

При необходимости оцените процент стареющих клеток, разделив количество ярких событий на общее количество событий. Активность бета-галактозидазы также можно оценить по средней интенсивности флуоресценции для анализа старения, индуцированного химиотерапевтической процедурой. Коммерчески доступную линию клеток множественной миеломы R RRP I 8 2 2 6 обрабатывали в течение двух дней доксорубицином, химиотерапевтическим препаратом; при проведении анализа на старение, как описано в данном видео, на этих гистограммах показана флуоресценция необработанных клеток слева и обработанных клеток справа.

В области V наблюдается популяция ярко помеченных клеток, представляющих сенесцентные клетки. Параллельно тот же образец клеток был окрашен с помощью анализа на бета-галактозидазу. На этом репрезентативном изображении показаны полностью синие и частично синие клетки, чтобы проиллюстрировать сложность различения истинно синих сенесцентных клеток. Для демонстрации специфичности C 12 FDG при определении процента сенесцентных клеток клетки также обрабатывали различными концентрациями доксорубицина.

Процент стареющих клеток определяли путем деления числа ярких событий на общее число событий. При дозах доксорубицина 5, 25 и 50 нМ процент стареющих клеток составил 0,8%, 15,78% и 26,31% соответственно. Это демонстрирует, что маркировка C 12 FTG специфична для стареющих клеток.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как количественно определять сенесцентные клетки с помощью проточной цитометрии, следуя данной процедуре, а также то, какие методы, такие как иммуномаркировка, могут быть применены для характеристики сенесцентных клеток. Не забывайте, что работа с DMSO или раковыми клетками может быть крайне опасной. При выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.