Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми

В данном протоколе мы начинаем с кормления личинок соответствующего генотипа кормом на основе E, содержащим все транс-A TR. Каждую личинку фиксируют булавками и препарируют в нормальном физиологическом растворе, после чего физиологический раствор заменяют на раствор Рингера с двумя миллимолями кальция и помещают препарат личинки на предметный столик микроскопа. Движения препарированной личинки записывают на видео с помощью CCD-камеры. Локально освещая нервную систему, мы можем воздействовать на нейронную активность определенного набора нейронов в заданный момент времени, одновременно контролируя движения того же интактного препарата.

Здравствуйте, я Тега из лаборатории доктора А. Здравствуйте, я Хи Косака, также из лаборатории доктора А, уровень Oph.

Локомоция представляет собой полезную модельную систему для изучения двигательных нейронных цепей. Благодаря высокоразвитым генетическим методам, описанным в данном протоколе, мы будем проводить оптогенетическую манипуляцию мотонейронами с одновременным мониторингом уровня движения. Используя лазеры конфикального микроскопа, можно стимулировать определенную группу нейронов и анализировать двигательные реакции на пространственно-временное воздействие на эти нейроны.

Итак, приступим. Поддерживайте линии мух K64 US CHR2 или K64 US NPHR в пластиковых контейнерах с обычным живым кормом. Добавьте раствор TL на основе дрожжей в соответствующих концентрациях и тщательно перемешайте. Распределите дрожжевую смесь по агару с яблочным соком.

Возьмите вторую или третью культуру SLA из пробирок. Перенесите культуру на чашку с дрожжевой средой, содержащей TR. Накройте чашку алюминиевой фольгой, чтобы TR находился в темноте. Инкубируйте культуру при 25 °C в течение соответствующего периода времени.

Это ПЗС-камера для визуализации целого лабораторного образца. Присоедините ПЗС-камеру к обычному конфокальному микроскопу с помощью разъема SEMA. Возьмите лоток A TRA и промойте его водой.

Чтобы удалить остатки пищи из организма, поместите личинку на холодное блюдо-ловушку спинной стороной вниз. Зафиксируйте ее энтомологическими булавками в области головы и хвоста. Добавьте безкальциевый физиологический раствор.

С помощью микроножниц сделайте небольшой разрез в области хвоста. Выполните продольный разрез вдоль дорсальной срединной линии. Будьте осторожны, чтобы не повредить вентральный нервный ствол и периферические нервы.

Сделайте небольшой латеральный надрез головной булавкой в каждом углу вскрытой брюшной стенки. Удалите внутренние органы, за исключением мозга и вентрального нервного шнура. Замените нормальный физиологический раствор раствором Рингера с кальцием для моделей (2 млн).

Установите сухой объектив с большим увеличением в конфокальный микроскоп и поместите лабораторный препарат на предметный столик микроскопа. С помощью красного лазера получите трансмиссионное изображение препарированного образца, чтобы локализовать брюшной нервный шнур при помощи конфокального микроскопа. Определите область интереса на трансмиссионном изображении; для определения конкретной области интереса полезно использовать увеличение.

Измените набор фильтров микроскопа для освещения светом с длиной волны 488 нм или 559 нм. Визуализируйте стенку тела, осветив препарат галогеновой лампой. Наблюдайте за препаратом с помощью ПЗС-камеры, подключенной к конфокальному микроскопу.

Восстановите движение стенки тела и переключите лазерный луч только на временное манипулирование нейронной активностью; при этом перистальтическое движение в том же интактном препарате наблюдается и регистрируется CCD-камерой. В данной лабораторной работе в моторных нейронах экспрессируется ChR2. Освещение одного или двух сегментов вентрального нервного ствола активирует моторные нейроны в этих сегментах, что, в свою очередь, вызывает сокращение мышц в соответствующих сегментах стенки тела, стимулируя другие сегменты вентрального нерва.

Холод вызывает сокращение других сегментов тела. NPHL экспрессировался в моторных нейронах при стимуляции нескольких сегментов брюшного нервного тяжа желтым лазером. Распространяющаяся волна останавливалась на соответствующем сегменте брюшной стенки.

После выключения лазера волна снова начинала распространяться от заблокиженного сегмента. В данном протоколе описывается процедура оптогенетического воздействия на нейронную активность с помощью лазеров в одном и том же инактивированном круговом уровне при движении. Во время данной диссекции нельзя повреждать вентральный нервный шнур и периферические нервы для обеспечения достаточной стимуляции.

Мощность освещения следует регулировать путем изменения мощности лазера, скорости сканирования или количества повторений в конфокальном микроскопе. На этом протокол завершен. Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.