Optogenetic Возмущение нейронной активности с лазерной подсветкой в ​​полу-нетронутыми Drosophila Личинки в движении

В этом протоколе мы начинаем с кормления личинки соответствующего генотипа пищей на основе Е, содержащей все транс-А TR. Каждую лабораторию прижимают и препарируют в нормальном физиологическом растворе для замены нормального физиологического раствора двумя миллирастворами кальция и устанавливают препарат БАДД на предметный столик микроскопа. Движение рассекаемой ДДДД снимается на видео с помощью ПЗС-камеры. Освещая нервную систему локально, мы можем возмущать нейронную активность подмножества нейронов в определенное время, наблюдая за движением одного и того же препарата.

Здравствуйте, я Тега в лаборатории доктора А. Привет, я Привет Косака, также в др. Лабораторный уровень Oph.

Локомоция является полезной модельной системой для изучения двигательных цепей. Благодаря высокоразвитым генетическим методам в этом протоколе, мы будем оптогенетически манипулировать моторными нейронами, отслеживая движение на уровне. Используя лазеры в конфокальном микроскопе, можно стимулировать подмножество нейронов и анализировать моторные реакции на пространственно-временные возмущения нейронов.

Итак, приступим. Поддерживайте нахлыстовые лески K six G four US CHR two или K six G four US NPHR в пластиковых био, содержащих стандартный живой корм. Добавьте раствор TL к дрожжам в нужной концентрации и хорошо перемешайте Разложите дрожжи на основе яблочного сока аате.

Подбирайте второй или третий по SLA из флаконов. Поставьте вестибюль на аате с дрожжевым пространством, содержащим TR. Накройте тарелку алюминиевой фольгой, чтобы TR оставался в темноте. Выращивайте лобби при температуре 25 градусов С в течение соответствующего периода времени.

Это ПЗС-камера для визуализации такой же неповрежденной лаборатории. Прикрепите ПЗС-камеру к обычному конфокальному микроскопу с помощью отделения SEMA. Поднимите лобби A TRA и промойте их водой.

Чтобы удалить остатки пищи с тела, положите лаву на холодную тарелку спинной стороной от нее. Приколите насекомыми булавками голову и хвост. Добавьте нормальный физиологический раствор без кальция.

Сделайте небольшой надрез возле хвоста микроножницами из разреза. Сделайте продольный разрез по спинной средней линии. Будьте осторожны, чтобы не повредить вентральное нервное ядро и периферические нервы.

Сделайте небольшой боковой надрез головки, приколите каждый угол рассеченной стенки тела. Удалите внутренние органы, кроме головного мозга и вентрального нервного канатика. Замените обычный физиологический раствор 2 миллионами модельного раствора кальциевого рингера.

Установите в конфокальный микроскоп сухую линзу объектива полной мощности и установите лабораторную подготовку на предметный столик микроскопа. Получите просвечивающее изображение расчлененного препарата с помощью красного лазера, чтобы определить местоположение вентрального нервного кода с помощью конфокального микроскопа. Определение области интереса на форме зума пропускающего изображения полезно для определения конкретной области интереса.

Замените набор фильтров микроскопа для освещения светом 488 или 559 нанометров. Визуализируйте стенку кузова, освещая препарат галогенной лампой. Контролируйте препарат с помощью ПЗС-камеры, прикрепленной к конфокальному микроскопу.

Вспомните движение стенки тела и переключите лазерный луч только на временное манипулирование нейронной активностью, при этом наблюдая за движением перистальтического движения в том же неповрежденном препарате, наблюдаемом и регистрируемом ПЗС-камерой. Эта лаборатория экспрессирует CHL 2 в современных нейронах. Освещение одного или двух сегментов вентрального нервного ядра активирует современные нейроны в сегментах, что, в свою очередь, вызывает сокращение мышц в соответствующих сегментах стенки тела, стимулируя другие сегменты вентрального нерва.

Холод вызывает сокращение других сегментов тела. NPHL экспрессировался в моторных нейронах, когда несколько сегментов вентрального нервного звонка стимулировались желтым лазером. Распространяющаяся волна задерживалась на соответствующем сегменте стенки тела.

Затем волна возобновлялась с остановленного сегмента, когда лазерная элиминация была выключена. Этот протокол разъясняет процедуру выполнения оптогенетического возмущения нейронной активности лазерами на одном и том же круговом уровне в движении. Код вентрального нерва и периферический нерв не должны быть повреждены во время этого расслоения для достижения достаточной стимуляции.

Мощность освещения должна регулироваться путем изменения мощности лазера, скорости сканирования или количества повторений в конфокальном микроскопе. Вот и весь протокол. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.