В ово CAM-анализа, как Xenograftmodel саркомы

Общая цель этой процедуры заключается в проведении анализа тоической мембраны цыплят или анализа CAM для изучения поведения саркомы, клеток или трансплантата. Это достигается путем создания окна в скорлупе яйца на третий день инкубации. На втором этапе на девятый день инкубации подготавливается опухолевый материал.

Затем, после удаления эпителиального слоя, опухоль добавляется к CAM На заключительном этапе на 16-й день инкубации CAM фотографируется, собирается и фиксируется в формалине для гистологической оценки. В конечном счете, классическая гистология и иммуногистохимия используются для демонстрации саркомы, пролиферации клеток и инвазионной васкуляризации, а также реакций хозяина. Основным преимуществом этой методики из существующих методов, подобных ксенотрансплантату большинства моделей, является то, что она проста в освоении и относительно дешева.

Это также позволяет изучить множество действий, связанных с метастазированием, за очень короткий период времени и не требует этического комитета. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований саркомы, такие как влияние взаимодействия опухоли с хозяином на выживаемость опухоли, восстановление микроокружения опухоли и рекрутирование клеток стромы. Применение этого метода распространяется на персонализированную терапию саркомы, поскольку может быть изучен собственный материал пациента.

Все эти новые методы могут дать нам новое понимание нейрогенеза SAR. Это также очень применимо к другим системам, таким как онкогенез в целом. Начните с того, что с помощью стерильного скальпеля разрежьте образец опухоли на небольшие кусочки, размером не более одного кубического миллиметра, удалив все кальцинированные участки.

Затем взвесьте образец и перенесите от двух до четырех граммов ткани в диссоциирующую трубку. Расщепляют ткани в 2,5 миллилитров коллагеназы двух и 2,5 миллилитров растворов DNA's. После обработки ткани, согласно протоколу диссоциации Н опухоли, отфильтровать полученную суспензию через клеточный фильтр размером 150 мкм.

Теперь центрифугируйте суспензию с соответствующей центробежной силой, например, от 100 до 500 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Осторожно удалив надосадочную жидкость с помощью пипетки, инкубировать гранулу в 10 миллилитрах лизиса эритроцитов, буферизировать при комнатной температуре с периодическим тированием. Через 10 минут добавьте 25 миллилитров питательной среды для остановки реакции после повторного раскручивания суспензии, гранула должна быть белого цвета, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте пять миллилитров среды в клетки, а затем профильтруйте суспензию через сетчатое фильтр для клеток 70 мкм.

Используйте автоматический счетчик клеток, чтобы определить количество живых клеток на миллилитр при развитии. На третий день вставьте иглу 18 калибра в кончик яйца и удалите два миллилитра альбумина, чтобы понизить уровень OVO chorio all toic membrane или cam. Теперь нанесите полупроницаемую клейкую пленку на отмеченную верхнюю сторону корпуса, чтобы предотвратить попадание частиц корпуса на кулачок во время резки окна.

Затем сделайте вводное отверстие с небольшим отверстием на поверхности яйца. Не повредить кулачок во время вскрытия оболочки – самая сложная часть процедуры. Мы используем острые ножницы, держа их горизонтально в одной руке, а в другой руке держим яйцо.

Теперь используйте стерильные хирургические ножницы с острым концом, чтобы вырезать квадратное окно в один сантиметр в оболочке. Пульсирующее сердце и прилегающие сосуды эмбриона теперь должны быть видны на поверхности яичного желтка. Удалите все неоплодотворенные яйцеклетки или мертвые эмбрионы.

Затем заклейте окно более полупроницаемой клеевой пленкой. После повторного вращения опухолевой суспензии повторно суспендируйте гранулу в охлажденном геле с внеклеточным матриксом в соотношении от 10 до шести клеток на 100 микролитров геля. Держите этот раствор на тающем льду.

Далее, под ламинарным потоком, с помощью стерильных хирургических ножниц иссекаем часть полупроницаемой клейкой пленки. Удалите слой эпителиальных клеток, слегка прикоснувшись к кулачку стерильным стеклянным стержнем. Затем добавьте 4 капли по 25 микролитров суспензии геля ЭХМ ячейки в кулачок, позволяя гелю ЭХМ полимеризоваться в промежутках между нанесениями.

Таким образом, создается адгезивная бляшка, содержащая раковые клетки. Затем снова заклейте оболочку окна полупроницаемой клеевой пленкой. После соответствующего экспериментального инкубационного периода используйте хирургические ножницы, чтобы увеличить окно скорлупы, следя за тем, чтобы не резать слишком низко.

Затем с помощью пипетки добавьте от 300 до 500 микролитров PBS в секцию CAM, содержащую инокулированный материал. Затем сфотографируйте камеру через стереофлуоресцентный микроскоп. После этого с помощью стерильных ножниц разрежьте мембрану на границе, прилегающей к раковине, и поместите собранный кулачок в стерильную чашку Петри, наполненную PBS или буферным формальдегидом.

Затем сфотографируйте верхнюю и нижнюю стороны кулачка, как с фильтром, так и без него. На этом первом рисунке опухолевые трансплантаты становятся адгезивными к кулачку. На этих двух изображениях можно наблюдать суспензию одиночных клеток из материала пациента с высохшей, слегка приподнятой бляшкой.

Показано заметное сморщивание мембраны, возникающее после иссечения кулачка. Линия SAO two образует расползающуюся бляшку над CAM с отчетливым увеличением поверхности с седьмого дня. После инокуляции сигнал GFP остается сильным, что указывает на жизнеспособность клеток.

Эти бляшки, содержащие клетки SW 1 3 53, демонстрируют уменьшение поверхности и имеют тенденцию к сужению кулачка, что приводит к морщинистой мембране. После сбора урожая с седьмого дня часто наблюдаются кровотечения. Сигнал DSR уменьшается по мере разбавления флуоресцентного зонда после многих делений клеток, а также в случае возникновения кровотечения.

В большинстве случаев наблюдается сосудистая реакция КАМ при попадании в образец новых извилистых сосудов. Например, ветвление, обозначенное наконечниками стрелок, и анастомозирование, обозначенное звездочками, в этом точечном кровотечении, как указано стрелками, также могут наблюдаться по всей бляшке. Обратите внимание на миграцию двух клеток САО, параллельных сосудам кулачка.

Эта сосудистая реакция может быть визуализирована после иссечения кулачка на нижнем виде, показывая извилистые сосуды, окружающие трансплантат или бляшку. Сосудистая реакция КАМ наблюдается в группе опухолевого трансплантата и группе одноклеточной суспензии. Гистологические данные показывают, что две клетки САО сохраняют одноклеточный вид по всему объему геля внеклеточного матрикса, что приводит к увеличению толщины и диаметра бляшки.

Опухолевые клетки проникают в мезодермальный слой кулачка, как показано здесь стрелкой, тем самым увеличивая расстояние между эндодермальным и дермальным слоями кулачка, как расстегивающаяся молния. Как показано двойной стрелкой, характер роста клеток SW 1 3 5 3 и одноклеточной суспензии саркомы в сознании пациента более сгруппирован с островками клеток в пространстве геля внеклеточного матрикса. Как указано стрелкой, несмотря на их эктопический участок роста, мы обнаружили, что основные особенности и иммуногистохимические характеристики исходных опухолей саркомы сохранялись в камере.

Кроме того, опухолевые трансплантаты были реваскуляризированы, о чем свидетельствует появление темно-розовых эритроцитов цыплят с ядрами, на что указывают стрелки и обнаруженные в сосудах количество KI 67 положительных и KI 67 отрицательных клеток показывает устойчивый рост общего количества клеток с четвертого дня для обеих клеточных линий. После этого дня общее количество клеток остается стабильным через семь дней после инокуляции, количество положительных клеток KI 67 и общее количество клеток начинает снижаться. Большая доля положительных клеток KI 67 наблюдается вблизи кулачка, а большая доля отрицательных клеток KI 67 наблюдается на поверхности бляшки.

После того, как техника cam SA будет освоена, ее можно будет использовать для анализа 50 раз за 14 часов в течение трех дней, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены дополнительные h и e окрашивания и оценка, которые требуют трех часов для каждого из 10 условий. Дополнительные методы, такие как визуализация образа жизни, могут быть выполнены для решения дополнительных проблем, таких как экстравазация или имплантация меченых гриппом раковых клеток.

Таким образом, разработка этой новой методики позволяет исследователям в области доклинических испытаний изучать новые прогностические и терапевтические факторы у пациентов с саркомой. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как применять опухолевый материал в CMAA и как переводить ваши микроскопические и микроскопические наблюдения для лучшего понимания взаимодействия опухоли с хозяином.