Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ

Общая цель следующего эксперимента заключается в разделении различных мембранных субкомпартментов и изучении различий в их белковом составе. Это достигается путем стабильного изотопного мечения клеток при разных условиях, что позволяет дифференцировать варианты обработки. На втором этапе масс-спектрометрического анализа клеточный материал из двух групп смешивается, что обеспечивает совместную обработку и снижает вариабельность между образцами.

Затем субкомпартменты плазматической мембраны очищают и разделяют на стерильные богатые и стерильные обедненные субкомпартменты с помощью сахарозы. В результате центрифугирования в градиенте плотности, на основании данных количественной масс-спектрометрии, определяют различную концентрацию белков в субкомпартментах при разных вариантах обработки. Основным преимуществом данного протокола по сравнению с существующими методами, такими как вестерн-блоттинг, является возможность количественной регистрации распределения тысяч белков по субкомпартментам и, таким образом, поиск новых кандидатов для изучения сигнальных процессов.

Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как освоить очистку двухфазной системы довольно сложно. Это обусловлено большим количеством этапов, а также необходимостью точного контроля и тщательного обращения с материалом. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области передачи сигналов путем поиска новых белков-кандидатов, выступающих регуляторами мембранных процессов. Начните с выращивания меченых и немеченых суспензионных культур клеток *Arabidopsis thaliana*, как описано в текстовом протоколе.

Гомогенизированные клетки из примерно одного литра семидневных суспензионных культур клеток в жидком азоте смешивают в стакане в равных количествах (по сырой массе) меченые и немеченые замороженные культуры клеток и добавляют два объема буфера H; стакан немедленно помещают на шейкер и перемешивают до полного размораживания материала и исчезновения кристаллов льда. Гомогенат фильтруют через один слой зеркальной ткани в центрифужные пробирки объемом 250 мл; после доведения образцов до одного объема буфером H центрифугируют при 10 000 G в течение восьми минут. После центрифугирования супернатант переносят в предварительно охлажденные ультрацентрифужные пробирки объемом около 32 мл.

После уравнивания объемов образцов буфером h осадите микросомы центрифугированием при 100, 000 Gs и температуре четырех градусов Цельсия в течение 30 минут. После центрифугирования удалите супернатант; супернатант содержит растворимые белки. Небольшое количество этой фракции можно сохранить для последующего осаждения белков и дальнейшего анализа растворимых белков. Ресуспендируйте мембранный осадок каждого образца в соответствующем количестве буфера R, как описано в текстовом протоколе, и нанесите на верхний слой двухфазной системы U one.

При использовании двухфазной системы массой шесть грамм нанесите ровно два грамма ресуспендированного осадка мембран и такой же объем чистого буфера R, который использовался для ресуспендирования образца, в пробирку U2. Медленно перемешайте содержимое пробирок U1 и U2, перевернув их 30 раз со скоростью примерно одна инверсия в секунду, затем центрифугируйте образцы при 1500 Gs и четырех градусах Celsius в течение 10 минут. После центрифугирования удалите верхнюю фазу из U2. Перенесите верхнюю фазу из U1 в U2 и повторите центрифугирование с теми же параметрами. Затем перенесите верхнюю фазу из U2 в пробирки для ультрацентрифугирования, разбавьте пятью объемами буфера R и тщательно перемешайте, после чего центрифугируйте образцы при 200,000 Gs и четырех градусах Celsius в течение одного часа.

Наконец, повторное использование. Ресуспендируйте осадок мембран в небольшом объеме буфера T and E для выделения детергент-резистентных мембран. После определения концентрации фракции плазматической мембраны с помощью анализа Брэдфорд добавьте Triton X 100 к фракции плазматической мембраны, соблюдая массовое соотношение детергента к белку от 13 до 15 и конечную концентрацию детергента от 0,5 до 1%. Перемешивайте образцы при скорости около 100 RPM и температуре 4 °C в течение 30 минут.

Затем добавьте три объема 2,4 М сахарозы к одному объему обработанной плазматической мембраны, чтобы получить конечную концентрацию сахарозы 1,8 М. Подготовьте градиент сахарозы в пробирках для ультрацентрифугирования, наслаивая соответствующие растворы сахарозы поверх фракции 1,8 М. Центрифугируйте образцы при 250 000 ×g и 4 °C в течение 18 часов. Осторожно извлеките пробирки из ротора, чтобы не нарушить полосу с низкой плотностью, которая может быть видна в виде молочного кольца на границе раздела растворов сахарозы 0,15 М и 1,4 М.

Иногда визуально ничего не наблюдается, однако фракция детергент-резистентных белков все равно присутствует. Снимите фракцию объемом 0,75 мл из верхней части градиента (фракции две и три), которые в совокупности составляют объем около 1,5 мл над интерфазным кольцом, а также 0,5 мл ниже интерфазного кольца.

Представляет собой фракцию детергент-резистентных мембран. Соберите эти фракции в 15 миллилитровые пробирки Falcon. Фракции девять и 10 содержат детергент-солюбильную мембранную фракцию; их также можно собрать для сравнения.

Для начала экстракции белков из детергент-резистентной фракции добавьте четыре объема метанола к собранным фракциям и тщательно перемешайте на вортексе. Затем добавьте один объем хлороформа и снова тщательно перемешайте на вортексе. В завершение добавьте три объема воды, тщательно перемешайте на вортексе и центрифугируйте образцы при 2000 Gs в течение пяти минут.

С помощью настольной центрифуги удалите водную фазу над белковым слоем в интерфазе. Затем добавьте три объема метанола и перемешайте на вортексе. Тщательно удалите супернатант S перед тем, как отобрать осадок для подготовки к перевариванию в растворе.

Начните процедуру переваривания в растворе, растворив образец в небольшом объеме 6 М мочевины и 2 М тиреоидного буфера с pH 8 (сокращенно UTU). Используйте минимально возможный объем, совместимый с образцом. После центрифугирования образцов и проведения переваривания, как описано в текстовом протоколе, разбавьте образец четырехкратным объемом 10 мМ Tris-HCl с pH 8.

Затем добавьте 1 µL трипсина на 50 µg белка образца, инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 700 RPM, после чего центрифугируйте образцы при 4,000 ×g в течение 10 минут. В завершение подкислите образцы до конечной концентрации 0.2% TFA для достижения pH 2, добавив примерно 1/10 объема 2% трифторуксусной кислоты. Для изготовления C18-stage tips поместите диск C18 на плоскую чистую поверхность, например, в одноразовую пластиковую чашку Петри.

Вырежьте небольшой диск с помощью гиподермической иглы с тупым концом диаметром 1.5 мм. Диск задерживается в игле, что позволяет перенести его в наконечник пипетки. Вытолкните диск из иглы и зафиксируйте его в сужающейся части наконечника пипетки, используя фрагмент плавленого кварца или трубку, подходящую по размеру к внутренней части иглы; кондиционируйте стадийный наконечник C 18, нанеся 50 µL раствора B на подготовленный стадийный наконечник.

Центрифугируйте наконечник при 2000 об/мин в течение двух минут. В настольной центрифуге уравновесьте наконечник с помощью 100 µL раствора a. Центрифугируйте наконечник при 5,000 ×g в настольной центрифуге. Повторите этапы уравновешивания и центрифугирования.

Загрузите образец на диск, осторожно внеся его пипеткой в наконечник, внутри которого находится диск. Центрифугируйте наконечники до тех пор, пока весь объем образца не пройдет через диск C 18. Дважды промойте наконечники с сорбентом 100 µL раствора A. После центрифугирования наконечников соберите элюат в чистую реакционную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 40 µL раствора B, и центрифугируйте.

Снова сконцентрируйте образец в вакуум-центрифуге (speed vac) при оптимальных условиях. Остановите процесс дегидратации, когда останется примерно один или два µL жидкости. В качестве завершающего этапа добавьте в образец суспензионный раствор Resus конечным объемом 9 µL и перенесите его в микротитрационный планшет для масс-спектрометрического анализа.

Обогащение белков плазматической мембраны может быть продемонстрировано с помощью протеомного анализа небольших аликвот плазматической мембраны, ее фракций и белков в нижней фазе двухфазной системы. Нижняя фаза содержит внутренние мембраны клетки. Например, типичные белки плазматической мембраны, такие как белки рецепторных киназ, проявляют высокую степень представленности во фракции плазматической мембраны и низкую степень представленности во фракции нижней фазы, содержащей внутренние мембраны.

В свою очередь, известные белки эндоплазматического ретикулума обнаруживались в большом количестве во фракции внутренней мембраны и отсутствовали во фракции плазматической мембраны. Последующее обогащение фракций детергент-резистентных мембран в идеале приведет к образованию молочно-белого кольца мембранных везикул низкой плотности. Как и ожидалось, наибольшее содержание белков remn было обнаружено во фракциях детергент-резистентных мембран (DRM) примерно на одной пятой высоты пробирки.

Напротив, белки, которые не присутствуют в мембранных микродоменах, такие как A b, C-транспортер, не демонстрируют повышенного содержания в DRM-фракции. Также типичные контаминанты, такие как митохондриальный белок из комплекса A TPAs F zero и рибосомальный белок 60 s рибосомы, не проявляют обогащения в DRM-фракции. Несмотря на то что после масс-спектрометрического анализа все еще могут быть обнаружены минимальные количества, соотношения содержания белков и статус фосфорилирования белков в фракциях плазматической мембраны меченых и немеченых культур клеток могут быть количественно разграничены.

Типичные результаты в окне количественного анализа МС должны демонстрировать соотношение интенсивности ионов один к одному для большинства идентифицированных пептидов. Пептиды, соотношение интенсивности ионов которых значительно отклоняется от одного к одному, считаются дифференциально регулируемыми между меченой и немеченой культурами клеток и являются кандидатами для сопоставления с белками, подверженными воздействию применяемого лечения. Хорошим контролем качества успешного метаболического мечения является коэлюция обеих версий пептидов (меченой и немеченой) в виде одного пика при разделении методом нано-ВЭЖХ, как показано здесь.

После освоения эта методика позволяет выполнить все этапы в течение трех дней — от начала экстракции до ввода образца в масс-спектрометр. В дальнейшем для получения дополнительных ответов о локализации конкретных целевых белков могут быть применены другие методы, такие как Western Belt. Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как смешивать культуры растительных клеток, меченных стабильными изотопами, как проводить очистку плазматической мембраны с использованием двухфазной системы и как отделять стериль-обогащенные мембранные субкомпартменты от стериль-обедненных.