Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ Арабидопсис Подвеска Клеточные культуры

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы разделить различные мембранные субкомпартменты и изучить их дифференциальный белковый состав. Это достигается за счет мечения стабильными изотопами клеток в различных условиях, что позволяет дифференцировать методы лечения. При масс-спектрометрическом анализе в качестве второго этапа материал клетки смешивается, что обеспечивает совместную обработку и снижает вариацию образца к образцу.

Затем субкомпартменты плазматической мембраны очищаются и разделяются сахарозой на стерильные, богатые и стерильные обедненные субкомпартменты. Получены результаты градиентного центрифугирования, которые показывают дифференциальное содержание белка в субкомпартментах при различных обработках на основе данных количественной масс-спектрометрии. Основное преимущество этого протокола перед существующими методами, такими как вестерн-блоттинг, заключается в том, что мы можем количественно регистрировать распределение тысяч белков по субкомпартментам и тем самым открывать новых кандидатов для сигнальных процессов.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как очистка двухфазной системы сложна для изучения. Причина этого в том, что он включает в себя множество этапов, и точный контроль и тщательное обращение очень важны. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигнализации путем открытия новых белковых кандидатов в качестве регуляторов мембранных процессов.

Гомогенизированные клетки примерно из одного литра семидневных культур клеточной суспензии в жидком азоте смешивают одинаковые количества меченых и немеченых замороженных клеточных культур на основе свежего веса в стакане и добавляют два объема буфера H, немедленно помещают стакан на шейкер и встряхивают до тех пор, пока материал не растает и не освободится от льда. Кристаллы фильтруют гомогенат через один слой зеркальной ткани в центрифужные пробирки объемом 250 миллилитров после балансировки образцов с буферной центрифугой H при давлении 10 000 G в течение восьми минут. После центрифугирования загрузите snat в предварительно охлажденные ультрацентрифужные пробирки объемом около 32 миллилитров.

После балансировки образцов с помощью буфера h гранулируют микросомы центрифугированием при 100 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После центрифугирования удаляют надосадочную жидкость, которая содержит растворимые белки. Небольшое количество этой фракции может быть сохранено для дальнейшего осаждения белка, а последующий анализ растворимых белков повторно суспендирует мембранную гранулу каждого образца в соответствующем количестве буфера R, как описано в текстовом протоколе, загружают в верхнюю часть двухфазной системы U.

Если используется двухфазная система весом шесть граммов, загрузите ровно два грамма ресуспензионной мембранной гранулы и загрузите на U2 тот же объем чистого буфера R, который используется для суспензии образца. Медленно перемешайте пробирки U-1 и U2, перевернув их 30 раз с примерно одной инверсией в секунду, центрифугируйте образцы при давлении 1500 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После центрифугирования удалите верхнюю фазу из U2. Перенесите верхнюю фазу из U-1 в U2 перед повторением центрифугирования с использованием тех же параметров. Затем переместите верхнюю фазу из U2 в ультраультрацентрифужные пробирки, разбавьте пятью объемами буфера R и тщательно перемешайте, центрифугируйте образцы при 200, 000 G и четырех градусах Цельсия в течение одного часа.

Наконец, повторное использование. Суспендируйте мембранную гранулу в небольшом количестве Т и Е буфера для изоляции мембран, устойчивых к моющим средствам. После проверки концентрации фракции плазматической мембраны с помощью анализа Брэдфорда добавьте Triton X 100 к фракции плазматической мембраны в соотношении детергента к белку, отношение массы к весу от 13 до 15 и конечную концентрацию моющего средства от 0,5 до 1%. Встряхните образцы при скорости около 100 об/мин и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.

Затем добавьте три объема 2,4 молярной сахарозы к одному объему обработанной плазматической мембраны для получения 1,8 молярной конечной концентрации сахарозы. Приготовьте градиент сахарозы в ультрацентрифужных пробирках, загрузив соответствующие растворы сахарозы поверх 1,8 молярной фракции Центрифугируйте образцы при температуре 250, 000 GS и четырех градусах Цельсия в течение 18 часов. Осторожно снимите ультрацентрифужные пробирки с ротора, чтобы избежать нарушения полосы низкой плотности, которая может быть видна в виде молочного кольца на границе 0,15 моляра и 1,4 моляра сахарозы.

Иногда ничего не видно, но устойчивая к моющим средствам белковая фракция все еще присутствует. Удалите фракцию объемом 0,75 миллилитра с вершины градиента, вторую и третью фракции, которые покрывают объемы около 1,5 миллилилитров над межфазным кольцом. И на 0,5 миллилитра ниже межфазного кольца.

Представляют собой детергентоустойчивую мембранную фракцию. Соберите эти фракции в пробирки Falcon объемом 15 миллилитров. Фракции 9 и 10 содержат растворимую в детергенте мембранную фракцию и также могут быть собраны для сравнения.

Чтобы начать экстракцию белков из детергентоустойчивой фракции, добавьте четыре объема метанола к собранным фракциям и тщательно обработайте вихрь. Затем добавьте один объем хлороформа, прежде чем снова тщательно перемешать. Наконец, добавьте три объема воды и тщательно центрифугируйте образцы при давлении 2000 G в течение пяти.

С помощью настольной центрифуги удалите водную фазу над слоем белка в интерфазе. Далее добавляем три объема метанола и вортекс. Тщательно удалите надосадочную жидкость S перед вытягиванием гранул для подготовки к разложению растворением.

Начните сбраживание раствором с растворения образца в небольшом объеме шесть моляров мочевины, два моляра щитовидной железы pH восемь сокращенно UTU. Используйте как можно меньший объем, совместимый с образцом. После вращения образцов и выполнения разложения, как описано в текстовом протоколе, разбавьте образец четырьмя объемами 10 миллимолярного триса HCL PH eight.

Затем добавьте один микролитр трипсина на 50 микрограмм образца белка, инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре при постоянной встряхивании при 700 об/мин, центрифугируйте образцы при 4 000 GS в течение 10 минут. Наконец, подкислите образцы до конечной концентрации 0,2% TFA до достижения второго pH путем добавления примерно одного 10-го объема 2%-ной три-фторуксусной кислоты. Для изготовления наконечников ступени C 18 поместите диск C 18 на плоскую чистую поверхность, например, на одноразовую пластиковую чашку Петри.

Выбейте небольшой диск с помощью тупого кончика иглы для подкожных инъекций диаметром 1,5 миллиметра. Диск вставляется в иглу и может быть перенесен в наконечник пипетки. Вытолкните диск из иглы и зафиксируйте его в сужающемся кончике пипетки с помощью куска плавленого диоксида кремния или фитинга трубки внутри иглы кондиционного кончика C 18, поместив 50 микролитров раствора B на подготовленный кончик ступени.

Вращайте наконечник в центрифуге со скоростью 2000 об/мин в течение двух минут В настольной центрифуге уравновесьте наконечник ступени, используя 100 микролитров раствора a. Вращайте наконечник при давлении 5 000 GS в настольной центрифуге. Повторите балансировку и вращение.

Загрузите образец на диск, осторожно отпив образец в наконечник пипетки так, чтобы диск находился внутри. Вращайте наконечники в центрифуге до тех пор, пока весь объем образца не пройдет через диск C 18. Промывайте наконечники ступени два раза 100 микролитрами раствора А. После вращения наконечников в центрифуге соберите ЭИТ в свежую реакционную пробирку объемом 1,5 миллилира на 40 микролитров раствора В и центрифугуйте.

Снова сконцентрируйте образец в скоростном вакууме в идеальных условиях. Остановите процесс обезвоживания, когда останется всего около одного-двух микролитров жидкости. В качестве заключительного шага добавьте в образец окончательный объем в девять микролитров раствора суспензии Resus и перенесите его на планшет для микротитров для анализа масс-спектра.

Обогащение белков плазматической мембраны может быть показано с помощью протеомного анализа малой элоквы плазматической мембраны, фракций и белков в нижней фазе двухфазной системы. Нижняя фаза содержит внутренние мембраны клетки. Например, обычно известные белки плазматических мембран, такие как белки рецепторкиназы, показали высокую распространенность во фракции плазматической мембраны и низкую распространенность в нижней фазовой фракции, содержащей внутренние мембраны.

В свою очередь, известные белки эндоплазматического ретикулума демонстрируют высокую распространенность во внутренней мембранной фракции и не наблюдались в фракции плазматической мембраны. Последующее обогащение детергентоустойчивых мембранных фракций в идеальных случаях приведет к образованию молочного кольца мембранных пузырьков низкой плотности. Примерно на одной пятой высоты пробирки наибольшее содержание белка remn было обнаружено в устойчивой к детергенту мембране или фракциях DRM, как и ожидалось.

И наоборот, белки, которые не присутствуют в мембране, микродоменах, таких как транспортер A, b, C, не демонстрируют повышенного содержания во фракции DRM. Кроме того, типичные загрязнители, такие как митохондриальный белок из комплекса A TPAs F zero и рибосомный белок из 60-х рибосомы, не демонстрируют обогащенного содержания во фракции DRM. Несмотря на то, что после масс-спектрометрического анализа все еще можно идентифицировать минимальные количества, коэффициенты распространенности белка в статусе фосфорилирования белка в плазматической мембране, фракции меченых и немеченых клеточных культур могут быть количественно различимы.

Типичные результаты из окна количественного определения МС должны показывать отношение интенсивности ионов один к одному для большинства идентифицированных пептидов. Те пептиды, у которых отношение интенсивности ионов значительно отклоняется от одного к одному, считаются дифференциально регулируемыми между меченой и немеченой клеточной культурой и являются кандидатами на соответствие белкам, затронутым применяемой обработкой. Хорошим контролем качества успешного метаболического мечения является объединение как меченых, так и немеченых пептидных версий в виде единого пика в нано-ВЭЖХ-разделении, как показано здесь.

После освоения этого метода его можно выполнить в течение трех дней от начала экстракции до загрузки образца на масс-спектрометр. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как Western Belt, чтобы ответить на дополнительные вопросы о суппликации специфических белков-мишеней. Таким образом, после просмотра этого видео у нас должно быть хорошее понимание того, как смешивать меченые стабильными изотопами культуры растительных клеток, как проводить очистку плазматической мембраны в двухфазной системе и как отделять стерильные богатые от стерильных истощенных мембранных субкомпартментов.