Эффективный метод обвалки Руководство Подготовиться Интактные Мышь носовой ткани с сохранением анатомической организации

Здравствуйте, я Дэвид Дантон из лаборатории доктора Вунга Линна в UMBC. В этом видео мы демонстрируем эффективный метод подготовки тканей носа мыши с сохранением анатомической организации. Данная методика позволяет получить единый образец, содержащий почти всю носовую ткань, включая респираторную и обонятельную, эпителиальную и субэпителиальную ткани.

Мы демонстрируем пошаговое удаление различных костей лицевого скелета вокруг носовых тканей, которое позволяет сохранить даже самые хрупкие структуры, такие как терминальные отделы главного обонятельного эпителия. Наш метод имеет значительные преимущества по сравнению с методами декальцинации, так как он исключает агрессивную химическую обработку, а удаление костей занимает от 20 до 30 минут. Другими преимуществами данной методики являются отсутствие ограничений по возрасту мыши и возможность ее применения как для фиксированных, так и для свежих тканей.

Эти преимущества делают наш метод идеальным для морфологических, иммуногистохимических и физиологических исследований. Здесь представлена схематическая диаграмма костей черепа и носа с дорсальной стороны. В данном видео мы сосредоточимся на препарировании костей носа.

На данной схеме представлена вентральная сторона костей черепа и носа. Это вид сверху, где в верхней части показаны недиссецированный череп и нос, а в нижней — диссецированный нос. В данный момент показаны терминальные отделы основного обонятельного эпителия.

Здесь мы демонстрируем кости носа, начиная с дорсального вида. Это дорсальная часть скуловой пластинки, за которой следует скуловая дуга. Это носовая кость, а далее представлена расположенная ниже решетчатая пластинка.

Ганглий Грюненберга расположен значительно спереди. При взгляде сбоку мы демонстрируем часть решетчатой кости, прикрывающую обонятельный эпителий носового хода, ганглий Грюненберга, верхнюю челюсть и передние резцы. Переходя к виду снизу, мы показали моляры, передние резцы, нёбную кость и сошник.

Начните удаление кости vomer, осмотрев нос с вентральной стороны. Чтобы удалить кость vomer, с помощью пинцета разломите её вдоль всей длины, а затем удалите фрагменты кости, отклоняя их от подлежащих тканей, чтобы избежать повреждения носового органа RO. Для этой задачи используйте инструменты для перелома вентральной части передних резцов.

Используя сжимающее движение, сломайте передние резцы в направлении кости Ульмера. После того как передние резцы будут сломаны, удалите с помощью пинцета оставшиеся фрагменты кости, прикрепленные к тканям. Чтобы высвободить верхнюю челюсть, начните с вентральной стороны и сломайте верхнюю челюсть непосредственно вентральнее скуловых дуг.

Откиньте нос к дорсальной стороне и переломите верхнюю челюсть непосредственно перед скуловой дугой. Чтобы ослабить фиксацию верхней челюсти для удаления правой части носовой кости, удалите остатки лобной кости справа от носовой кости. Для этой задачи используйте щипцы Ронже.

При использовании инструментов Ron следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить тонкую решетчатую пластинку, так как повреждение решетчатой пластинки может привести к разделению носа пополам. Откиньте и удалите обломок кости. Затем откиньте дорсальную часть скуловой пластинки от подлежащих тканей.

Разделите носовую кость вдоль ее средней линии. Используя пинцет или эразиум, захватите кость пинцетом и осторожно перемещайте ее из стороны в сторону, приподнимая. Эту процедуру следует проводить с осторожностью, так как при удалении кости легко повредить подлежащую ткань. После удаления кости можно отдельно рассмотреть подлежащую ткань, что показано на данном статичном изображении.

Чтобы удалить кость, просто вырежьте ее с помощью пинцета или ножниц. Теперь приступайте к удалению передней части верхней челюсти. Если она еще не была удалена к этому моменту, то передняя часть верхней челюсти уже должна быть подвижной, поэтому удалите ее, разорвав все оставшиеся связи с тканями.

Рассматривая образец с дорсальной стороны, удалите лобную кость, которая прилегает к левой стороне носовой кости. Используйте рондовые кусачки, чтобы разломать лобную кость. Для извлечения этого фрагмента лобной кости можно использовать рондовые кусачки или пинцет.

В это время можно также ослабить фиксацию верхней челюсти, хотя это не обязательно. Чтобы удалить левую часть носовой кости, используйте пинцет и осторожно отделите носовую кость от многих окружающих ее костей. Затем захватите эту кость пинцетом и аккуратно перемещайте ее из стороны в сторону, одновременно приподнимая, чтобы отделить носовую кость от подлежащих тканей.

По мере отделения подлежащей ткани от кости иногда можно использовать боковой ракурс, чтобы увидеть места прикрепления ткани к кости. С помощью пинцета осторожно отделите ткань, прикрепленную к кости, после чего удалите кость с помощью ножниц или пинцета. После удаления носовой кости удалите переднюю часть верхней челюсти с левой стороны носа, используя ту же технику, что и при удалении передней части верхней челюсти с правой стороны носа.

Следующим шагом является удаление скуловой пластинки с левой стороны носа. Скуловая пластинка и подлежащие ткани могут оставаться частично прикрепленными; в этом случае можно использовать зубчатый пинцет, чтобы осторожно зажать и ослабить дорсальную часть скуловой пластинки. Осмотрите нос с вентральной стороны.

Для идентификации моляров и небной кости можно удалить либо моляры, либо небную кость. Сначала представлен вид носа сбоку, на котором показано удаление моляров с правой стороны носа. Затем, используя urs с удаленной правой стороной верхней челюсти, удаляется небная кость.

Затем раздробите оставшуюся часть верхней челюсти и моляров, удалив крупные костные фрагменты из нёбной кости или верхней челюсти. Отломите и удалите любые оставшиеся части решетчатой кости, выступающие в сторону эпителия. Поместите тонкий пинцет под кость и приподнимите её, чтобы отделить от подлежащей ткани.

В качестве альтернативы используйте инструменты Rogers, как показано здесь, чтобы разломить кость, а затем с помощью тонкого пинцета отделите кость от подлежащей ткани. Так выглядит носовая раковина обонятельного эпителия человека. После этого данная кость будет удалена.

Затем, в области латеральнее и медиальнее носовой кости, эта кость удаляется с помощью щипцов. Соблюдайте осторожность на этом этапе, чтобы не повредить решетчатую пластинку. После разлома кости извлеките её с помощью пинцета.

Далее представлен вид носовой полости. После удаления этой кости следует проверить последнюю область — вокруг V-носового органа. Это необходимо, так как парные трубки V-носового органа разделены костью, которую я удаляю в данный момент в ходе данной диссекции.

На данном изображении представлен вид сверху на нос, препарированный с использованием нашего метода. Далее мы повернули нос, чтобы показать его с разных ракурсов. Сначала показан вид сверху, затем — вид сбоку (слева), а в конце — вид снизу.

Теперь мы подробно продемонстрируем особенности носа, полностью препарированного с использованием нашего метода, начиная с дорсальной стороны. В первой части мы покажем носовые раковины основного рефракторного эпителия. В тканях под носовыми костями имеются пузырьки воздуха; эти пузырьки удаляются путем вакуумирования образца при взгляде сбоку.

Мы демонстрируем сохранную носовую раковину обонятельного эпителия человека. Обратите внимание на наличие пузырьков воздуха внутри носовых раковин. Железистая ткань расположена спереди от носовой раковины, а респираторный эпителий виден при данном латеральном ракурсе.

При взгляде с вентральной стороны виден уязвимый носовой орган. На этом изображении показан расширенный вариант нашей методики диссекции, при которой луковицы обонятельного нерва головного мозга и нос удаляются из одного образца. Чтобы подготовить ткань к сечению, сначала возьмите пластиковую форму и заполните ее средой для оптимальной температуры резки (OCT-средой).

Поместите исследуемую ткань в заполненную форму, а затем установите форму внутри кольца из силиконовой смазки на пластиковом чашечке; на кольцо силиконовой смазки будет установлена колба для создания герметичного уплотнения для вакуума. В нашей лаборатории используется вакуум, создаваемый с помощью проточной воды. Как только вакуум будет создан потоком воды, пузырьки воздуха будут удалены из ткани.

Вакуум отключают, перекрыв подачу воды и отсоединив трубки. Затем извлекают пластиковую форму. На этом этапе я перемещаю ткань в нужное положение перед ее замораживанием.

В нашей лаборатории для замораживания тканей используется сухой лед. Здесь представлены результаты получения срезов носа с использованием нашей методики диссекции и окрашивания нейтральным красным. Это горизонтальный срез, на котором видны носовые раковины, эпителий главного эффектора, железистая ткань и респираторный эпителий.

Вторым является корональный срез, демонстрирующий сложную систему складок носовых раковин основного обонятельного эпителия. В данном видео мы демонстрируем метод ручного удаления костей носа для получения образца, оптимального для морфологических, иммуногистохимических или физиологических исследований.