Измерение экономического роста и динамика экспрессии генов опухолей, ориентированные С. Typhimurium Бактерии

Общая цель этого эксперимента — изучить динамику экспрессии генов in vivo бактерий S. tyrian, растущих внутри опухолей. Сначала в модели рака ксенотрансплантата мыши бактерии вводятся внутривенно через хвостовую вену. Бактерии колонизируют опухоль и растут экспоненциально, в то время как экспрессия генов визуализируется с помощью люминесцентных репортеров.

Биолюминесцентная визуализация всего животного выполняется с помощью системы визуализации спектра ВСУЗИ. В течение 24-48 часов проводится курс визуализации ВСУЗИ. Эта серия изображений коррелирует с количеством колоний, полученных в результате гомогенизации и осаждения опухолей.

В совокупности эти данные позволяют количественно измерять экспрессию генов и динамику популяции бактерий-мишеней опухолей in vivo в режиме реального времени при прохождении клеточной подготовки, клеточных линий с использованием стандартных методов культивирования клеток. В этом эксперименте мы использовали восемь клеток до целевой плотности от 80 до 100%Собирайте и подсчитывайте клетки на гемо, цитометре, ресуспенде, и фенол красный свободный DMEM в целевой концентрации от пяти до 10 до семи клеток на миллилитр, или около 200 микролитров на колбу. Добавьте на 15% уменьшенный фактор роста и держите клеточную суспензию на льду до имплантации опухоли.

Анестезировали четырехнедельных самок голых мышей с использованием 3% изофтора. Загрузите клетки по 100 микролитров на опухоль в одномиллиметровый шприц и прикрепите иглу 27 с половиной калибра к каждому из двух двусторонних мест инъекции заднего фланга. Аккуратно поднимите кожу с помощью щипцов, чтобы сделать палатку, и введите клетки в основание.

Следите за тем, чтобы не проникнуть слишком глубоко, вырабатывая кровь. С помощью пинцета аккуратно удалите шприц без брызг. Ежедневно контролируйте рост опухоли в течение 10-20 дней, пока не будет достигнут диаметр опухоли от двух до четырех миллиметров.

Подготовка бактерий, начните культивирование бактерий в течение ночи в среде с тремя милами LB плюс антибиотики из морозильной камеры минус 80 или охлаждаемой тарелки. В этом эксперименте мы использовали штамм ELH четыре 30 утром. Разбавьте культуру от одного до 100 в отфильтрованном фунте и вырастите до наружного диаметра 600 от 0,4 до 0,6.

Убавьте обороты и промойте три раза в фосфатно-солевом буфере и повторно суспендируйте при окончательном наружном диаметре 600 0,1 или примерно один раз по 10 до семи клеток на мил. Вводите бактерии, обезболивайте животных и принимайте положение так, чтобы хвост был направлен к доминирующей руке. Найдите хвостовую жилу и расширьте ее с помощью теплой воды или тепловой лампы.

Загрузите бактерии по 100 микролитров на мышь в один мил шприц и согните чип чуть менее чем на 90 градусов. Совместите кончик шприца с хвостовой веной, проникните на небольшую глубину, не чувствуя сопротивления, и введите бактерии. Наблюдайте за смещением кровотока для успешной инъекции.

Подождите примерно от 12 до 18 часов перед визуализацией, чтобы произошла колонизация. Визуализация на мышах обезболивает животных в индукционной камере. Затем поместите каждую мышь на платформу визуализации.

Поддерживайте точное позиционирование для получения количественных результатов между временными точками, визуализируйте животных с помощью системы визуализации Ibis Spectrum. При визуализации более чем одного животного установите между ними световые барьеры, чтобы предотвратить вскрытие животного перекрестным светом, удерживая опухоль пинцетом. Снимите кожу обратным движением ножниц.

Движение: Когда большая часть кожи будет полностью отделена, удалите опухоль с помощью пинцета. Поместите органы и предварительно взвешенные микроцентрифужные пробирки. Поскольку масса этих пробирок может значительно варьироваться, важно предварительно взвесить их для получения количественных результатов.

Количественная оценка биораспределения бактерий для каждой временной точки иссечения и взвешивания опухолей добавляет 500 микролитров PBS плюс 15% глицерина и гомогенизирует с использованием разрыва ткани, генерирует серийное разведение и подсчет бактериальных колоний с репрезентативными результатами. Используя этот протокол, мы можем генерировать данные о росте in vivo и динамике экспрессии генов бактерий-мишеней опухолей. Общий рабочий процесс кратко изложен здесь.

На первом этапе мы ввели бактерии и визуализировали животное с помощью ИВУС для измерения экспрессии генов с люминесценцией в качестве репортера. Затем, на втором этапе, мы иссекли, гомогенизировали и поместили опухоли на колонию, чтобы определить количество бактерий, растущих в опухоли. Биолюминесценция, генерируемая бактериальными штаммами, визуализируется с помощью увеличения сигнала ВСУС с введенной дозой с минимальной колонизирующей дозой примерно в пять раз 10 до пяти во всех случаях из-за ослаблений.

Бактерии либо специфически колонизированы опухолями, либо не могут значительно вырасти у мышей. Сигнал количественно оценивается с использованием единиц излучения для нормализации по времени воздействия, или типичные значения от 10 до шести или более указывают на колонизацию для данной инфекции. Пик заболеваемости наступает примерно через 36 часов после инъекции, но сроки могут варьироваться в зависимости от используемого штамма и плазмиды. Убедитесь, что мышь каждый раз находится точно в одном и том же положении, чтобы обеспечить количественные результаты в следующей серии экспериментов.

Биораспределение бактерий количественно измеряется для измерения роста бактерий с течением времени в различных органах, жизнеспособные бактерии и опухоли количественно оцениваются путем иссечения и гомогенизации опухоли и ее серийного разведения. Другие органы могут быть количественно определены. Аналогичным образом, здесь мы использовали селезенку, поскольку соотношение опухоли и селезенки является типичной мерой бактериальной специфичности после обратного расчета с использованием коэффициента разведения.

Эти подсчеты позволяют нам измерять конкретную популяцию бактерий с течением времени. Слева мы видим, как количество бактерий неуклонно растет на протяжении всего эксперимента. С удвоением времени от одного до трех часов, значительно ниже, чем в периодических экспериментах с культурой.

Вероятно, это связано с плохим содержанием питательных веществ в опухолевом микроокружении. Справа мы количественно оценили соотношение опухоли и селезенки и заметили, что оно увеличивается на протяжении всего эксперимента. Целью этих экспериментов является количественный мониторинг динамики роста и экспрессии генов бактерий и опухолевых сред с использованием методов визуализации ВСУЗИ и подсчета колоний.

Мы показали, что популяции бактерий могут быть охарактеризованы in vivo в опухолевой среде. В будущем могут быть разработаны и спроектированы более сложные программы экспрессии генов для создания сложных терапевтических систем доставки бактерий.