Измерение экономического роста и динамика экспрессии генов опухолей, ориентированные

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении динамики экспрессии генов бактерий S tyrian in vivo при их росте внутри опухолей. Сначала в мышиной модели ксенотрансплантата рака бактерии вводят внутривенно через хвостовую вену. Бактерии колонизируют опухоль и растут экспоненциально, в то время как экспрессия генов визуализируется с помощью люминесцентных репортеров.

Биолюминесцентная визуализация целого животного выполняется с использованием системы спектральной визуализации IVIS. В течение 24–48 часов проводится серия снимков IVIS в определенные временные интервалы. Эта серия изображений сопоставляется с количеством колоний, полученным путем гомогенизации опухолей и их посева на чашки

В совокупности эти данные позволяют нам количественно измерять экспрессию генов и популяционную динамику опухоле-таргетных бактерий in vivo в режиме реального времени при подготовке клеток, пассировании и использовании клеточных линий с помощью стандартных методов культивирования клеток. В данном эксперименте мы использовали клетки Ocar 8, доводя их общую плотность до целевого значения 80–100%. Соберите и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем ресуспендируйте их в DMEM без фенолового красного до целевой концентрации 5×10⁷ клеток/мл, или примерно 200 µL на колбу. Добавьте 15% Matrigel с пониженным содержанием факторов роста и держите клеточную суспензию на льду до момента имплантации опухоли.

Четырехнедельных самок мышей линии nude анестезировали с помощью 3% изофлурана. Клетки набирали в шприц объемом 1 мл из расчета 100 µL на одну опухоль и прикрепляли иглу калибра 27,5 для проведения инъекций в два билатеральных участка заднего бока. Кожу осторожно приподнимали пинцетом, создавая «палатку», и вводили клетки в основание.

Следите за тем, чтобы не ввести иглу слишком глубоко, чтобы не вызвать кровотечение. Осторожно извлеките шприц с помощью пинцета, избегая разбрызгивания. Ежедневно контролируйте рост опухоли в течение 10–20 дней, пока ее диаметр не достигнет двух-четырех миллиметров.

Подготовка бактерий: начните культивирование бактерий в 3 мл среды LB с добавлением антибиотиков в течение ночи, используя замороженный сток из морозильника -80 °C или охлажденный чашку с культурой. В данном эксперименте мы использовали штамм E. coli ELH430. Утром разведите культуру в соотношении 1:100 в фильтрованной среде LB и выращивайте до достижения OD 600 от 0,4 до 0,6.

Центрифугируйте и трижды промойте осадок в фосфатно-солевом буферном растворе, затем ресуспендируйте до конечного значения OD 600 0,1 или примерно 1 × 10⁷ клеток/мл. Для инъекции бактерий анестезируйте животных и расположите их так, чтобы хвост был направлен в сторону вашей доминирующей руки. Найдите хвостовую вену и расширьте её с помощью теплой воды или тепловой лампы.

Наберите бактерии в шприц объемом 1 мл из расчета 100 µL на одну мышь и согните иглу под углом чуть менее 90 градусов. Совместите кончик шприца с хвостовой веной, введите иглу на небольшую глубину, не ощущая сопротивления, и введите бактерии. Убедитесь в успешности инъекции, наблюдая за смещением кровотока.

Подождите примерно от 12 до 18 часов перед проведением визуализации, чтобы произошла колонизация. Для визуализации мышей анестезируйте животных в индукционной камере. Затем поместите каждую мышь на платформу для визуализации.

Для обеспечения количественной сопоставимости результатов в разные моменты времени строго соблюдайте точность позиционирования при визуализации животных с помощью системы имиджинга Ibis Spectrum. Если визуализируется более одного животного, разместите между ними световые барьеры для предотвращения перекрестного освещения. Выполните диссекцию животного, удерживая опухоль пинцетом. Удалите кожу, используя обратное движение ножниц.

Движение. Когда большая часть кожи будет отделена, полностью удалите опухоль с помощью пинцета. Поместите органы в предварительно взвешенные микроцентрифужные пробирки. Поскольку масса этих пробирок может существенно варьироваться, для получения количественных результатов важно взвесить их заранее.

Для количественного определения биораспределения бактерий для каждой временной точки иссекают и взвешивают опухоли, добавляют 500 µL PBS с 15% глицерином и гомогенизируют с помощью гомогенизатора тканей, затем готовят серийные разведения и высевают их на чашки для подсчета бактериальных колоний; представлены типичные результаты. Используя данный протокол, мы можем получать данные о динамике роста и экспрессии генов бактерий, нацеленных на опухоль, in vivo. Общая схема рабочего процесса представлена здесь.

На первом этапе мы ввели бактерии и провели визуализацию животного с помощью ivus для измерения экспрессии генов, используя люминесценцию в качестве репортера. Затем на втором этапе мы вырезали, гомогенизировали и высеяли опухоли для подсчета колоний, чтобы определить количество бактерий, растущих в опухоли. Биолюминесценция, генерируемая бактериальными штаммами, визуализируется с помощью ivus; сигнал возрастает пропорционально введенной дозе, при этом минимальная колонизирующая доза во всех случаях составляет около 5 × 10⁵ из-за затухания сигнала.

Бактерии либо специфически колонизируют опухоли, либо не демонстрируют значительного роста у мышей; сигнал количественно оценивается в единицах радиометрического излучения (radiance units) для нормализации по времени экспозиции, при этом типичные значения 10⁶ и выше свидетельствуют о колонизации при данной инфекции. Сигнал увеличивается с течением времени в течение 24–48 часов. В данном случае пик наступает примерно через 36 часов после инъекции, однако время может варьироваться в зависимости от используемого штамма и плазмиды. Обязательно располагайте мышь точно одинаково при каждом измерении, чтобы обеспечить количественную сопоставимость результатов в последующих сериях экспериментов.

Количественное определение биораспределения бактерий проводится для оценки роста бактерий с течением времени в различных органах; количество жизнеспособных бактерий в опухолях определяют путем иссечения и гомогенизации опухоли с последующим высевом ее серийных разведений. Аналогичным образом может быть проведено количественное определение в других органах. В данной работе была использована селезенка, так как соотношение количества бактерий в опухоли и селезенке является типичным показателем специфичности бактерий после пересчета с учетом фактора разведения.

Эти подсчеты позволяют нам измерять конкретную популяцию бактерий с течением времени. Слева видно, что число бактерий неуклонно растет на протяжении всего эксперимента. Время удвоения составляет от одного до трех часов, что существенно ниже, чем в экспериментах с культурами в периодическом режиме.

Вероятно, это связано с недостаточным содержанием питательных веществ в микроокружении опухоли. Справа мы количественно определили соотношение опухоли и селезенки и заметили, что оно увеличивается на протяжении всего эксперимента. Целью данных экспериментов является количественный мониторинг динамики роста и экспрессии генов бактерий и опухолевого окружения с использованием визуализации IVUS и методов подсчета колоний.

Мы продемонстрировали, что популяции бактерий могут быть охарактеризованы in vivo в условиях опухолевого микроокружения. В будущем могут быть разработаны и сконструированы более сложные программы экспрессии генов для создания высокотехнологичных систем бактериальной доставки терапевтических средств.