Генерация подкожного и Внутрипеченочный гепатоцеллюлярной карциномы человека ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Общей целью этой процедуры является получение подкожной или внутрипеченочной гепатоцеллюлярной карциномы человека или ксенотрансплантатов ГЦК у мышей с иммунодефицитом. Это достигается путем предварительной подготовки фрагментов опухоли или суспензии одиночных клеток из свежего образца ГЦК человека для имплантации мышам для подкожного введения ксенотрансплантатов. Следующим шагом является введение опухолевых клеток или имплантация фрагментов опухоли в подкожный дорсальный карман для внутрипеченочных ксенотрансплантатов.

Следующим шагом является введение опухолевых клеток в селезенку или печень или имплантация фрагментов опухоли непосредственно в печень на заключительном этапе. За животными наблюдают в течение нескольких недель, пока не разовьются опухоли. В конечном счете, ксенотрансплантаты ГЦК человека могут быть использованы для изучения многих аспектов биологии опухолей, включая механизмы опухолегенеза и реакцию на новые методы лечения.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование только клеточных линий или подкожных ксенотрансплантатов, заключается в том, что с помощью этого метода первичные образцы рака печени человека и внутрипеченочные ксенотрансплантаты, полученные от пациента, обеспечивают более реалистичную биологическую модель гепатоцеллюлярной карциномы человека. Демонстрировать процедуру будет Шариф Ахмед, научный сотрудник моей лаборатории по подкожной имплантации фрагментов опухоли. Сначала поместите мышь под наркозом в положение лежа, поддерживая ингаляционную изофторную анестезию мундштуком.

Нанесите слезный гель, чтобы защитить глаза животного от травматических повреждений, а затем простерилизуйте тыльную часть бритья хирургическим скрабом Бетадином, затем 70% этанолом и, наконец, раствором повидон-йода. Далее с помощью острых ножниц сделайте пятимиллиметровый разрез на коже. Введите кончик закрытых тупых ножниц в подкожное пространство, а затем осторожно откройте ножницы, чтобы образовался карман, достаточно большой для размещения фрагмента опухоли.

Затем с помощью пары тонких щипцов введите фрагмент опухоли в подкожный карман с помощью зажимов, чтобы закрыть разрез после того, как фрагмент был помещен непосредственно перед инъекцией, суспензию лотоса опухолевых клеток в матригеле в инсулиновый шприц, закрытый иглой 29 калибра на полдюйма. Затем введите иглу в подкожное пространство обезболившего и побритого животного, продвигая иглу на несколько миллиметров по подкожной плоскости в сторону от места прокола, и выпустите содержимое шприца, чтобы подготовить животное к приживлению опухолевой тканью человека. Начните с подкожного введения 350 микролитров стерильного физиологического раствора с помощью иглы 27 калибра на полдюйма на одномиллилилитровом шприце в тыльную сторону шеи животного, находящегося под наркозом, чтобы превентивно компенсировать любую потерю интраоперационной жидкости.

Затем после обезболивания лежачей мыши на предварительно разогретой подушечке разгибайте конечности животного и фиксируйте их скотчем к операционной поверхности для оптимизации обнажения брюшной полости и грудной клетки. Расположите увеличительную лампу над животным, а затем простерилизуйте выбритую кожу на брюшной полости и грудной клетке, как показано выше. С помощью острых ножниц сделайте поперечный двусторонний подреберный разрез кожи, а затем разделите мышечные слои, чтобы обнажить всю печень.

Наложите шов на кожу над мечевидным отростком и закрепите его на мундштуке лентой, чтобы обеспечить лучшее воздействие на печень и окружающие структуры. Затем стабилизируйте печень с помощью двух аппликаторов с ватными наконечниками, расположенных рядом с тканью и позади нее. Затем с помощью острых ножниц разделите серповидную связку, прикрепленную к срединной доле печени.

Мобилизуйте левую долю печени с помощью аппликатора с ватным наконечником и расположите свободный красивый узел из пяти шелковых швов вокруг мочки. Продвинуте узел как можно ближе к биножке левой доли, а затем затяните его. Затем с помощью ножниц иссеките мочку дистальнее лигатуры, оставив небольшой пенек, чтобы предотвратить соскальзывание узла и последующее кровоизлияние.

Используя аналогичную технику, перевязать и резекировать большую часть срединной доли печени, а затем с помощью хирургического вмешательства и мягкого надавливания аппликатором с ватным наконечником вдоль поверхностей разреза паренхимы печени добиться полного гемостаза. Наконец, проведите внутрипеченочный ксенотрансплантат фрагмента опухоли или опухолевых клеток или внутрипеченочный ксенотрансплантат опухолевых клеток с помощью инъекции селезенки, как показано в следующих разделах. Для внутрипеченочной имплантации фрагментов опухоли используйте лезвие скальпеля No 10, чтобы сначала сделать разрез длиной и глубиной три миллиметра на поверхности печени.

Затем немедленно нанесите хирургический раствор и мягко надавите на место разреза в течение 60-90 секунд для достижения гемостаза Когда будет достигнут полный гемостаз, с помощью тонкого щипца поместите фрагмент опухоли в разрез печени. Затем наложите небольшой кусочек хирургического препарата на разрез для печеночной имплантации опухолевых клеток путем прямого введения в печень. Введите иглу инсулинового шприца, загруженную суспензией опухолевых клеток, в подвергшуюся воздействию печень и продвинуте кончик на несколько миллиметров за пределы места прокола по субкапсулярной плоскости.

Аккуратно выгрузите содержимое шприца и извлеките иглу из печени. Затем поместите хирургический препарат на место прокола и слегка надавите аппликатором с ватным наконечником, чтобы предотвратить утечку суспензии опухолевых клеток и достичь полного гемостаза для внутрипеченочного ксенотрансплантата опухолевых клеток путем введения в селезенку. Расположите мышей в правом боковом положении пролежня и с помощью острых ножниц сделайте левый подреберный разрез в один сантиметр для входа в брюшную полость.

Затем используйте аппликатор с ватным наконечником, чтобы отразить желудочную впадину в правый бок животного. Чтобы обнажить селезенку, обрабатывая окружающие жировые ткани тонкими травматическими щипцами, доставьте селезенку в разрез и поместите дубликатор с ватным наконечником за селезенкой для стабилизации тканей. Теперь с помощью шелкового шва толщиной пять о поместите свободный узел претти вокруг селезенки над нижним полюсом.

Введите заряженную инсулиновую шприце суспензию опухолевых клеток в нижний полюс селезенки и продвинуте ее за уровень рыхлого красивого узла. Затем медленно выпустите содержимое шприца, извлеките иглу из селезенки и затяните узел, чтобы не допустить утечки введенной клеточной суспензии. Наконец, перенесите селезенку в брюшную полость.

На этом изображении показан образец резекции печени от пациента с ГЦК, который не получал никакой адъювантной терапии опухоли. Белым прямоугольником обозначен жизнеспособный участок опухоли вблизи периферии, который был получен для ксенотрансплантата. Развитие и рост подкожных ксенотрансплантатов можно легко контролировать путем ежедневного осмотра мышей-реципиентов.

Например, показан типичный внешний вид подкожного ксенотрансплантата ГЦК человека, который визуально отличается от окружающих тканей и соответствующий гистопатологический вид опухоли. Гистология опухоли демонстрирует типичные особенности ГЦК, в том числе гепатоцитоподобные клетки с ядерным AIA и высоким ядровым цитоплазматическим соотношением, отсутствие портальных дорожек и искаженные трабекулы с увеличенной толщиной гепатоцеллюлярных пластин. На этих изображениях типичный внешний вид внутрипеченочного ксенотрансплантата ГЦК человека, полученного при прямой имплантации опухолевой ткани в печень, а также при введении опухолевых клеток в селезенку, показан внутрипаренхиматозными опухолями, обозначенными черной стрелкой на каждом изображении.

Этот гистологический срез по краю внутрипеченочного трансплантата XOG демонстрирует типичные особенности ГЦК человека и прилегающей к нормальной печени мыши. В таблице обобщены показатели приживления опухолей, достигнутые после имплантации тканей первичной гепатоцеллюлярной карциномы человека у мышей с иммунодефицитом. Используя различные методы, только что продемонстрированные для каждого метода имплантации, знаменатель скорости удаления опухоли отражает уникальный образец ГЦК человека.

Эти данные демонстрируют, что для первичных тканей ГЦК человека скорость подкожного приживления ниже, чем скорость внутрипеченочного приживления, достигаемого путем внутрикишечного введения опухолевых клеток селезенки или имплантации фрагмента опухоли внутрипеченочно, и что частичная гепатэктомия, по-видимому, улучшает внутрипеченочное приживление. Пытаясь использовать эту процедуру, важно помнить об использовании стерильной техники и достижении полного гемостаза, так как маленькие мыши с ослабленным иммунитетом в возрасте от шести до восьми недель восприимчивы к инфекциям и могут не выжить даже при небольшом послеоперационном кровотечении.