Улучшение Шанс белка кристаллизации случайным Microseed Matrix скрининга

Общая цель этой процедуры заключается в улучшении количества и дифракционных качеств белковых кристаллов, полученных в ходе эксперимента по скринингу кристаллизации. Для этого кристаллический или осажденный материал идентифицируют с помощью существующего эксперимента по скринингу кристаллизации белка, проводимого с использованием целевого белка, представляющего интерес, собирают кристаллический или осажденный материал и затем используют его для получения кристаллического исходного материала. Затем создается серия кристаллизационных экранов, содержащих как целевой белок, представляющий интерес, так и кристаллические затравки.

Наконец, кристаллизационные сита с затравкой контролируются на предмет образования кристаллов и характеризуются любые новые кристаллы белка. В конечном счете, применение этой процедуры может привести к увеличению размера, количества и дифракционного качества белковых кристаллов, полученных в экспериментах по скринингу кристаллизации. Основные преимущества этого метода перед существующими методами, например, традиционным микропосевом или макропосевом, заключаются в том, что он может быть выполнен быстро, обладает высокой масштабируемостью и имеет значительно большее пространство для кристаллизации, чем другие методы затравки.

Еще одним преимуществом данной методики является то, что она не требует использования высококачественного кристаллического исходного материала для производства семенного материала. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется значительная степень ловкости рук во время этапов сбора кристаллов и манипуляций с ними. Наглядная демонстрация критичности метода, так как микропосев случайной матрицы значительно отличается от других методов затравки кристаллов.

Тонкости этого метода являются ключом к успеху, и некоторые из них сложно точно передать в текстовой форме. Начинайте эту процедуру только с сидячей кристаллизационной ложе, используя бинокулярный микроскоп или систему визуализации кристаллов. Осматривайте лоток каждый день в течение первой недели.

Затем раз в неделю после этого записывайте размер кристаллов. Как только нет признаков дальнейшего роста, выберите одну или несколько подходящих лунок из лотка, из которых будет собираться кристаллический материал. Для создания семенного материала может быть использован любой материал, в том числе тонкие иглы, шпиальные светильники, микрокристаллы и кристаллы неправильной формы, плохо сформированные.

Более старый материал с большей вероятностью будет частично сшитым и менее пригоден для использования в экспериментах по посеву. В день сбора урожая с помощью воспаленных булочек сделать закругленный щуп из стеклянной пастбищной пипетки. Для этого нагрейте пипетку ближе к середине, пока она не станет мягкой.

Затем быстро выньте его из пламени и вытяните, раздвинув концы. Стремитесь потянуть стекло вниз до диаметра менее 0,25 миллиметра в точке, где он составляет около 0,25 миллиметра. Разбейте стекло и ненадолго погрузите сломанный конец в пламя.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока на конце не образуется полусфера стекла диаметром примерно 0,75 миллиметра. Поместите на лед микроцентрифугу объемом 1,5 миллитра, содержащую затравочный шарик. Далее откройте выбранный лоток для кристаллизации.

Ну и на 24 хорошо подвешены поддоны. С помощью пинцета снимите крышку. Затем переверните крышку и положите ее на устойчивую чистую поверхность.

На 96 хорошо сидячих подносов. С помощью скальпеля разрежьте пластиковую потолочную пленку на верхней части выбранной лунки, а затем удалите вырезанную часть потолочной пленки с помощью пинцета. Удалите 50 микролитров раствора резервуара и переложите эту жидкость в микроцентрифужную трубку, содержащую зародыш, гарантируя, что пробирка останется на льду на протяжении всей этой процедуры.

Важно выполнить это точно так, как описано, и как можно быстрее. Позаботьтесь о том, чтобы тщательно раздавить семенной материал зондом и извлечь как можно больше, рассматривая образец под микроскопом. С помощью подготовленного ранее стеклянного щупа тщательно измельчите кристаллы на крышке.

Скольжение падает. Для полного дробления мелких кристаллов может потребоваться несколько минут. Кристаллы, которые легко поддаются дроблению, не сшиты и не являются кристаллами соли.

В то время как кристаллы соли издают характерный щелчок, который можно услышать и почувствовать при их дроблении. Затем удалите пять микролитров раствора резервуара из пробирки с затравочными шариками и переместите в эквивалентную подлунку для эксперимента с сидячей каплей или в защитный стакан для эксперимента с висячей каплей, содержащей кристаллический материал, который необходимо собрать. Пипетируйте эту жидкость вверх и вниз пять-шесть раз, чтобы повторно суспендировать как можно больше подводной лунки или закрыть содержимое слипа.

Верните суспензию в пробирку с бисером и повторите этот шаг еще дважды, убедившись, что собрано как можно больше кристаллического материала. Вортекс, затравите бусину на две минуты, останавливаясь каждые 30 секунд для охлаждения трубки на льду. В 1,5 миллилитровых пробирках содержится резервуарный раствор.

Сделайте серию разведения для архивного разведения семенного материала в резервуарном растворе в 4-10 раз на каждой стадии. Если семена, подвой и разбавления не будут использованы сразу, поместите от 10 до 20 микролитров аликвот в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов по Цельсию или при температуре минус 80 градусов по Цельсию для хранения. После замораживания семенные запасы могут храниться в течение неопределенного времени до тех пор, пока они не понадобятся.

Кристаллизационный скрининг RMMS может быть выполнен с использованием либо 24-луночных тарелок с использованием метода диффузии висячих капель пара, либо тарелок на 96 лунок с использованием метода диффузии сидячих капель пара. Для проведения MMS-скрининга в 24 хорошо подвешенных лотках с помощью пипетки вручную передают 300 микролитров каждого состояния с кристаллизационного экрана 96 условий в 10 миллилитров. Формат одной трубки в каждую лунку от 4 до 24.

Хорошо смазанные предварительно смазанные кристаллизационные тарелки из каждого резервуара объемом 300 микролитров передают по одному микролитру каждого условия кристаллизации на поверхность соответствующего пластикового покровного стекла, из которого были удалены как передняя, так и задняя защитные подложки на один микролитр. На покровный лист добавьте один микролитр белкового раствора, затем 0,5 микролитра кристаллического семенного материала. В первом раунде RMMS важно не использовать раствор разбавленного семенного материала.

Так как чем больше концентрация семян, тем больше будет получено попаданий кристаллизации. Переверните каждую крышку так, чтобы капля жидкости была направлена вниз и расположилась выше соответствующего значения. Хорошо надавите вниз на защитное стекло, сжимая потолочную смазку, и образуя надежное уплотнение.

Как только все 96 капель установятся, перенесите лоток либо в инкубатор при температуре от 4 до 18 градусов Цельсия, либо в помещение с постоянной температурой для хранения. Для выполнения нашего MMS скрининга в 96 году, хорошо сидят откидные лотки. Используйте кристаллизационный робот или восьмиканальную пипетку для переноса от 20 до 50 микролитров каждого состояния с кристаллизационного сита с 96 условиями в формате блока глубоких лунок в каждую соответствующую лунку кристаллизационного лотка.

Далее перенесите, 1,0 микролитра белкового раствора, 1,0 микролитра кристаллизационного состояния и 0,5 микролитра семенного материала в капли. Запечатайте лоток с помощью прозрачного потолочного листа и перенесите его в инкубатор при температуре от четырех до 18 градусов Цельсия или постоянной температуре. Эксперименты по хранению следует осматривать один раз в 24 часа в течение пяти дней после установления, а затем один раз в семь дней в течение четырех недель с помощью бинокулярного микроскопа или системы визуализации кристаллов. Осмотрите каждую подводную лунку или защитный стакан в последовательности и запишите любые признаки образования кристаллов.

Сравните результаты наших экспериментов по скринингу MMS с результатами скрининга без ЭД и зафиксируйте любые различия. При этом может потребоваться несколько циклов RMMS. Перед оптимальным дифракционным качеством образуются кристаллы для дополнительных циклов.

Используйте архивные разведенные исходные фонды по мере необходимости, чтобы контролировать количество кристаллов в лунке. Для демонстрации эффективности РММС. Методы скрининга применяли для кристаллизации хны, белого лизоцима и катализатора печени крупного рогатого скота для каждого состояния белка 3 96.

Для кристаллизационных экранов использовали J-C-S-G-P-A-C-T и Morpheus. Затем, через пять дней, из каждого лотка было выбрано одно условие, которое поддерживало рост кристаллического материала, и использовалось для создания семенного материала. Через пять дней были осмотрены лотки для кристаллизации и зафиксировано количество капель с кристаллами.

На этом рисунке обобщены результаты этого эксперимента и представлен количественный анализ лизоцима белка куриного яйца. При применении RMMS к этому белку наблюдалось четырех-десятикратное увеличение частоты успешной кристаллизации по сравнению с лотками без ЭД. Примечательно, что для каталазы печени крупного рогатого скота было обнаружено только одно условие в скрининге Морфеуса, дающее кристаллы, по сравнению с 55 состояниями, выявленными после использования RMMS.

Кроме того, во всех случаях наблюдалось трех- и двукратное увеличение частоты успешной кристаллизации банок из печени крупного рогатого скота с использованием скринингов JCSG и PACT соответственно, и независимо от используемого скрининга кристаллизации, наш скрининг MMS дал значительно большее общее количество кристаллов, чем скрининг без RMMS. Мы пришли к выводу, что наша MMS является простым, но мощным подходом, который может значительно повысить вероятность успеха экспериментов по скринингу кристаллизации белка. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперимент по скринингу матрицы случайных микросемян, начиная с идентификации и сбора кристаллического материала через подготовку кристаллического семенного материала и, наконец, заканчивая установлением кристаллизации семян после освоения.

Эту технику можно сделать менее чем за один час. Для экспериментов по скринингу микропосева случайной матрицы с использованием робота-манипулятора для работы с жидкостями или примерно за три часа, для экспериментов, выполняемых вручную. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что все кристаллизационные сита с затравкой хорошо запечатаны перед хранением.