Пассивации поверхности для одиночных молекул белка исследований

Общая цель этой процедуры заключается в получении кварцевой поверхности предметного стекла превосходного качества. Это достигается путем предварительной очистки просверленных кварцевых стекол и крышек водой и ацетоном. Затем предметное стекло протравливается гидроксидом калия и раствором пираньи для улучшения качества поверхности.

Затем предметные стекла и защитные стекла функционализируются аминными группами, за которыми следуют два раунда поверхностного покрытия с использованием полимера, чтобы сделать поверхность стекла инертной. Заключительным этапом является сборка микрофлюидной камеры из предметного стекла и крышки с покрытыми полиэтиленгликолем или пегилированными поверхностями, обращенными друг к другу. В конечном счете, новая стратегия обработки поверхности молекулами ПЭГ в течение двух раундов значительно улучшает качество пассивации, наблюдаемое с помощью флуоресцентной микроскопии с одной молекулой.

Основным преимуществом этой методики или существующих методик, таких как полимерное покрытие после травления оксидом калия, является то, что эта техника гарантирует превосходное качество. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, так как необходимо проводить несколько сеансов лечения. Чтобы начать бурение, кварцевые слайды скользят, как подробно описано в текстовом протоколе.

Очистите предметные стекла, поместив их в стеклянную банку для окрашивания. Как правило, в одну банку можно поместить от 5 до 15 предметных стекол. Затем промойте слайды ультраэфирной водой после трехкратного ополаскивания, прополощите слайды ультразвуком в течение пяти минут, чтобы удалить грязь, утилизируйте воду и промойте слайды еще три раза ультраэфирной водой.

Затем замените воду UE ацетоном и проработайте предметные стекла ацетоном в течение 20 минут или дольше, выбросьте ацетон и промойте предметные стекла водой Milli Q, чтобы удалить остатки ацетона. Затем замените воду одним молярным гидроксидом калия и обрабатывайте предметные стекла ультразвуком в течение 20 минут или дольше. Чрезмерное травление улучшит качество поверхности, но приведет к появлению царапин, которые могут помешать флуоресцентной визуализации.

Промойте предметные стекла водой Milli Q три раза, чтобы удалить следы гидроксида калия, выполните травление пираньи. Перенесите слайды в держатель для слайдов Duran или изготовленный на заказ тефлоновый держатель и поместите их в стакан объемом один литр, который находится в химической вытяжке. Наполните стакан 450 миллилитрами серной кислоты.

Затем добавьте 150 миллилитров перекиси водорода для соотношения три к одному между серной кислотой и перекисью водорода. Перемешайте раствор для правильного перемешивания и оставьте стакан в покое на 20 минут. Выньте предметные стекла из раствора пираньи и поместите их в держатель предметного стекла с водой.

Как только он достигнет комнатной температуры, трижды промойте предметные стекла водой UE после очистки крышки. Замените воду в посуде для окрашивания метанолом. Храните предметные стекла и крышки в метаноле.

Тем временем приготовьте раствор для островизации амино, насыпав в колбу 100 миллилитров метанола. Затем добавьте пять миллилитров уксусной кислоты и три миллилитра трех аминопропил, триметил, и аккуратно перемешайте, встряхивая. Замените метанол в посуде для окрашивания, содержащей предметные стекла и защитные стекла, смесью реакции аминосилизации.

Инкубировать от 20 до 30 минут во время инкубации, облучать ультразвуком один раз в течение одной минуты. Далее замените реакцию островизации амино метанолом. Затем выбросьте метанол и добавьте свежий раствор метанола.

Повторите эту процедуру три раза для первого раунда обработки поверхности Сначала используя полимер, высушите предметные стекла и защитные стекла с помощью газообразного азота. Затем поместите их в чистые коробки для дозаторов, частично заполненные водой milli Q, таким образом, чтобы сторона, которую необходимо пегилировать, была обращена вверх. Далее добавьте 64 микролитра свежеприготовленного реакционного буфера в готовый раствор для пег.

Пипеткой передавайте смесь вверх и вниз, чтобы она полностью растворилась. Затем центрифугировать при 16, 100 G в течение одной минуты. Чтобы удалить пузырьки воздуха, капните 70 микролитров пегилированной смеси на высушенное кварцевое стекло.

Аккуратно положите на раствор высушенный покровный лист, выдержите предметные стекла в темном и влажном помещении в течение двух часов или на ночь, чтобы сохранить пегилированные стекла и покровные стекла. Осторожно разберите затвор и крышку, сдвинув крышку в свою сторону и промыв их водой UE перед сушкой газообразным азотом. Поместите пару предметных стекол и защитных колпачков в трубку объемом 50 миллилитров так, чтобы пегилированные поверхности были обращены друг к другу.

Частично закройте пробирку и пропылесосьте ее, прежде чем наполнить газообразным азотом и плотно закрутить крышку. Храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Эти действия помогают сохранить пегилированную поверхность в течение длительного периода времени.

Выполните второй раунд пегилирования, как описано в текстовом протоколе, непосредственно перед использованием предметного стекла для сборки микрофлюидной камеры. Поместите кварцевое предметное стекло на плоскую поверхность пегилированной стороной вверх. Сделайте канал по диагонали на пегилированной поверхности, наклеив на горку двусторонний скотч.

Убедитесь, что отверстия расположены в центре канала. Затем аккуратно положите сверху пегилированную крышку, чтобы завершить камеру. Пегилированной стороной вниз.

Загерметизируйте камеру, прижав защитное стекло к местам, где размещена двусторонняя лента. Делайте это аккуратно, но тщательно, чтобы камера стала герметичной, водонепроницаемой. Наконец, закройте края камеры эпоксидным клеем.

Продолжайте иммобилизовать стрептавидин или neut travain и добавить биотинилированные биологические молекулы для визуализации одной молекулы, как описано в текстовом протоколе, если поверхностная обработка была выполнена успешно, на каждую наблюдаемую область визуализации приходится менее 10 неспецифически абсорбированных белков. Когда в камеру добавляется от одного до 10 наномолярных флуоресцентно меченых белков, когда ни одна из стадий очистки или реакции не была проведена должным образом, количество неспецифически абсорбированных белков значительно увеличивается. Например, если пропустить травление пираньи, то наблюдается в 100 раз больше неспецифической абсорбции.

Здесь ярко показана превосходная природа двойного пегилирования. Было замечено, что фоновые сигналы от флуоресцентных молекул и раствора были намного слабее при использовании двойной пегилации, как показано на левой панели. Это указывает на то, что белки более эффективно отталкиваются двойным пегилированным слоем.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. Не забывайте, что работа с AYA может быть чрезвычайно опасной, такие как надлежащие перчатки, очки и фартук, всегда должны быть приняты во время выполнения этой процедуры.