Пассивации поверхности для одиночных молекул белка исследований
24 апреля 2014 г.
Мы опишем метод для пассивации поверхности стекла с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ). Этот протокол охватывает очистки поверхности, поверхности функционализации и PEG покрытие. Введем новую стратегию для обработки поверхности с молекулами ПЭГ в течение двух раундов, что дает высокое качество пассивации по сравнению с существующими методами.
Общая цель данной процедуры заключается в получении кварцевого предметного стекла с высококачественной активацией поверхности. Это достигается путем предварительной очистки просверленных кварцевых предметных стекол и покровных стекол водой и ацетоном. Затем поверхность стекла подвергается травлению гидроксидом калия и раствором Пиранья для повышения качества поверхности.
Затем предметные стекла и покровные стекла функционализируют аминогруппами, после чего проводят два цикла модификации поверхности полимером для придания стеклянной поверхности инертности. Заключительным этапом является сборка микрофлюидной камеры из предметного и покровного стекол таким образом, чтобы поверхности, покрытые полиэтиленгликолем (пегилированные), были обращены друг к другу. В конечном итоге новая стратегия обработки поверхности молекулами ПЭГ в два этапа значительно повышает качество пассивации, что подтверждается данными флуоресцентной микроскопии единичных молекул.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методиками, такими как полимерное покрытие после травления оксидом калия, является гарантия более высокого качества. Лицам, впервые применяющим данный метод, может быть сложно, так как требуется выполнение нескольких этапов обработки. Для начала работы подготовьте кварцевые предметные стекла согласно текстовому протоколу.
Очистите предметные стекла, поместив их в стеклянный стакан для окрашивания. Обычно в один стакан можно поместить от пяти до 15 стекол. Затем промойте стекла водой сверхчистой (UE) очистки, повторив промывку трижды; подвергните стекла ультразвуковой обработке в воде сверхчистой очистки в течение пяти минут для удаления загрязнений, слейте воду и промойте стекла сверхчистой водой еще три раза.
Затем замените воду UE ацетоном и подвергните предметные стекла ультразвуковой обработке в ацетоне в течение 20 минут или более, после чего слейте ацетон и промойте стекла водой Milli Q для удаления остатков ацетона. Далее замените воду 1 M раствором гидроксида калия и подвергните стекла ультразвуковой обработке в течение 20 минут или более. Избыточное травление улучшит качество поверхности, но приведет к появлению царапин, которые могут помешать флуоресцентной визуализации.
Промойте предметные стекла водой Milli Q трижды, чтобы удалить следы гидроксида калия перед проведением травления раствором Пиранья. Перенесите стекла в держатель для предметных стекол Duran или изготовленный на заказ тефлоновый держатель и поместите их в стакан объемом один литр, находящийся в вытяжном шкафу. Наполните стакан 450 миллилитрами серной кислоты.
Затем добавьте 150 миллилитров перекиси водорода, чтобы соотношение серной кислоты и перекиси водорода составило 3:1. Перемешайте раствор для обеспечения однородности и оставьте стакан в покое на 20 минут. Извлеките предметные стекла из раствора Пиранхи и поместите их в держатель для стекол с водой Millieu.
Тем временем слейте раствор «пиранья» в специальную бутыль для отходов. После того как предметные стекла достигнут комнатной температуры, трижды промойте их сверхчистой водой (UE water), следуя процедуре очистки покровных стекол. Замените сверхчистую воду в лотках для окрашивания метанолом. Храните предметные и покровные стекла в метаноле.
Тем временем приготовьте раствор для аминирования поверхности, налив в колбу 100 миллилитров метанола. Затем добавьте пять миллилитров уксусной кислоты и три миллилитра 3-аминопропилтриметоксисилана и осторожно перемешайте путем встряхивания. Замените метанол в кюветах для окрашивания, в которых находятся предметные стекла и покровные стекла, на реакционную смесь для аминирования.
Инкубируйте в течение 20–30 минут, при этом один раз проведите соникацию в течение одной минуты. Затем замените реакционную смесь для изоляции аминогрупп метанолом. После этого слейте метанол и добавьте свежий раствор метанола.
Повторите эту процедуру три раза для первого этапа функционализации поверхности. Сначала высушите предметные и покровные стекла потоком азота. Затем поместите их в чистые кюветы для наконечников, частично заполненные водой Milli-Q, так чтобы сторона, подлежащая пегилированию, была обращена вверх. После этого добавьте 64 µL свежеприготовленного реакционного буфера к подготовленному раствору ПЭГ.
Произведите пипетирование смеси (вверх-вниз) для полного растворения. Затем центрифугируйте при 16 100 G в течение одной минуты. Для удаления пузырьков воздуха нанесите 70 µL смеси для пегилирования на сухой кварцевый предметное стекло.
Осторожно накройте раствор высушенным покровным стеклом; инкубируйте предметные стекла в темном и влажном месте от двух часов до ночи для хранения пегилированных предметных и покровных стекол. Осторожно разделите предметное и покровное стекла, сдвинув покровное стекло в сторону, и промойте их деионизированной водой перед высушиванием потоком азота. Поместите пару из предметного и покровного стекол в пробирку объемом 50 мл таким образом, чтобы пегилированные поверхности были обращены друг от друга.
Частично закройте пробирку и создайте в ней вакуум, после чего заполните ее газообразным азотом и плотно закрутите крышку. Храните при температуре -20 °C. Эти действия помогают сохранить пегилированную поверхность в течение длительного периода времени.
Проведите второй раунд пегилирования, как описано в текстовом протоколе, непосредственно перед использованием предметного стекла для сборки микрофлюидной камеры. Поместите кварцевое стекло на плоскую поверхность пегилированной стороной вверх. Сформируйте канал по диагонали на пегилированной поверхности, наклеив на стекло двусторонний клейкий скотч.
Убедитесь, что отверстия расположены по центру канала. Затем осторожно накройте камеру пегилированным покровным стеклом, обратив пегилированную сторону вниз.
Герметизируйте камеру, прижав покровное стекло к областям, где нанесен двусторонний скотч. Делайте это осторожно, но тщательно, чтобы камера стала водонепроницаемой. В завершение загерметизируйте края камеры эпоксидным клеем.
Перейдите к иммобилизации стрептавидина или нейтравидина и добавьте биотинилированные биологические молекулы для визуализации одиночных молекул, как описано в текстовом протоколе; если функционализация поверхности прошла успешно, в наблюдаемой области визуализации обнаруживается менее 10 неспецифически абсорбированных белков. При добавлении в камеру флуоресцентно меченого белка в концентрации от 1 до 10 нМ, если какой-либо из этапов очистки или реакции был выполнен неправильно, количество неспецифически абсорбированных белков значительно увеличивается. Например, если пропустить травление раствором пиранья, наблюдается в 100 раз более высокая неспецифическая абсорбция.
Здесь наглядно демонстрируются преимущества двойного пегилирования. Как показано на левой панели, фоновые сигналы от флуоресцентных молекул и раствора были значительно слабее при использовании двойного пегилирования. Это указывает на то, что слой с двойным пегилированием более эффективно отталкивает белки.
После освоения данной методики ее выполнение при правильном подходе занимает четыре часа. Не забывайте, что работа с AYA может быть крайне опасной, поэтому при проведении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование подходящих перчаток, защитных очков и фартука.
Обзор
В данной статье описывается новый метод пассивации стеклянных поверхностей с использованием полиэтиленгликоля (PEG). Протокол включает очистку поверхности, функционализацию и стратегию двухэтапного нанесения покрытия из PEG, которая повышает качество пассивации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Пассивация поверхности
- Микрофлюидика
- Флуоресцентная микроскопия
Введение
- Пассивация имеет решающее значение для снижения неспецифического связывания при флуоресцентной визуализации.
- Традиционные методы могут не обеспечивать оптимального качества поверхности.
- ПЭГ известен своими инертными свойствами, что делает его подходящим для данной области применения.
- Улучшенная обработка поверхности может повысить эффективность результатов эксперимента.
Цель исследования
- Разработать надежный метод очистки и пассивации стеклянных поверхностей.
- Продемонстрировать эффективность двухэтапной обработки ПЭГ.
- Предоставить подробный протокол для использования исследователями.
Используемые методы
- Очистка кварцевых предметных стекол водой и ацетоном.
- Травление с использованием гидроксида калия и раствора «пиранья».
- Функционализация поверхностей аминогруппами.
- Нанесение ПЭГ в два этапа для обеспечения высококачественной пассивации.
Основные результаты
- Двукратная обработка ПЭГ значительно улучшает пассивацию поверхности.
- Флуоресцентная микроскопия одиночных молекул демонстрирует снижение неспецифического связывания.
- Правильное выполнение протокола обеспечивает оптимальные результаты.
- Несоблюдение этапов может привести к усилению неспецифической абсорбции белков.
Выводы
- Описанный метод представляет собой более эффективную альтернативу для пассивации стеклянной поверхности.
- Используя данный протокол, исследователи могут добиться более качественных результатов визуализации.
- При этом крайне важно уделять пристальное внимание деталям в процессе очистки и обработки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Пассивация поверхности является критически важным условием для проведения надежных исследований белка на уровне одиночных молекул, поскольку она напрямую влияет на качество данных в анализах взаимодействия целевых объектов. Недостаточная обработка поверхности приводит к возникновению побочного неспецифического связывания, что затрудняет интерпретацию механизмов и увеличивает частоту ложноположительных результатов на ранних этапах поиска. Данный протокол устраняет ключевую техническую проблему, предлагая надежный и воспроизводимый метод создания инертных поверхностей, что повышает прогностическую достоверность в последующих рабочих процессах скрининга и валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет осуществлять специфическое наблюдение белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий за счет минимизации артефактов, вызванных воздействием поверхности.
- Практическая ценность: предоставляет стандартизированный метод подготовки поверхности, который снижает вариабельность результатов в различных экспериментах и лабораториях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает готовность анализа, гарантируя низкий уровень фона (<10 неспецифически абсорбированных белков на область визуализации) для точного измерения связывания лигандов.
- Практическая ценность: Стратегия двухэтапного ПЭГилирования повышает однородность покрытия, улучшая воспроизводимость в форматах высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет обеспечения точного количественного определения кинетики и аффинности связывания в системах, релевантных для данного заболевания.
- Практическая ценность: позволяет осуществлять длительное хранение пассивированных предметных стекол при -20°C, что упрощает серийную подготовку и обеспечивает непрерывность рабочего процесса.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод пассивации поверхности применим на ранних этапах исследований, в частности, он поддерживает стадии валидации мишеней и разработки анализа, обеспечивая надежную основу для визуализации отдельных молекул.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез за счет четкой визуализации специфических биомолекулярных взаимодействий без помех со стороны поверхности.
- Скрининг: обеспечивает получение количественных, воспроизводимых результатов, необходимых для сравнения эффектов соединений при первичном и вторичном скрининге.
- Аналитика: позволяет получать данные флуоресценции с низким уровнем фона, что улучшает соотношение сигнал/шум и облегчает точный статистический анализ событий связывания.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническим этапом, гарантируя, что наблюдаемые взаимодействия отражают реальные биологические процессы, а не артефакты анализа.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную платформу подготовки поверхностей, применимую в нескольких проектах и для различных классов мишеней.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет сокращения количества ложноположительных результатов, вызванных неспецифическими взаимодействиями на поверхности.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря четко определенному пошаговому протоколу с понятными критериями качества.
- Стратегическая ценность: способствует принятию более обоснованных решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет повышения надежности данных на ранних этапах оценки мишени.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию с учетом рисков, предоставляя более качественные данные о механизме действия для отбора ведущих соединений.
Особенности реализации
- Для правильного выполнения многоэтапной обработки требуются экспертные знания в области химии поверхности и флуоресцентной микроскопии.
- Процесс зависит от наличия оборудования для работы с раствором «пиранья», а также азота для сушки и хранения.
- Необходим стандартизированный инструктаж для обеспечения единообразной аминизации и двойного ПЭГилирования всеми пользователями.
- Метод должен быть адаптирован под различные материалы предметных стекол (например, кварц в сравнении со стандартным стеклом) при сохранении плотности ПЭГ и качества пассивации.
- Ограничением является высокая опасность раствора «пиранья», что требует строгого соблюдения протоколов безопасности и процедур по утилизации отходов.
