Локализация и относительное количественное определение углеродных нанотрубок в клетках с помощью проточной цитометрии с мультиспектральной визуализацией

Общая цель данного эксперимента заключается в создании нанометрологического метода для мониторинга и количественной оценки клеточного поглощения углеродных нанотрубок в статистически значимом числе клеток. Это достигается путем предварительной обработки клеток диспергируемыми в воде углеродными нанотрубками, которые поступают в клетки в зависимости от концентрации. Эти углеродные нанотрубки в конечном итоге помечаются флуоресцентным маркером.

Затем, после фиксации, каждая клетка визуализируется в светлом поле, темном поле и флуоресцентных каналах мультиспектрального потока изображений. Цитометр. Чтобы визуализировать распределение углеродных нанотрубок и уровень поглощения света, рассеянного света и флуоресценции, мечение нанотрубками индуцируется в каждой клетке на попиксельной основе. В конечном счете, собственное поглощение и рассеяние света в клетках позволяет локализовать и количественно оценить углеродные нанотрубки.

Таким образом, этот метод может помочь ответить на новые вопросы в области нанотоксикологии и наномедицины, такие как влияние и судьба материалов на основе углерода в живых клетках, а также потенциал углеродных нанотрубок в качестве системы доставки лекарств. Затем обработайте нанотрубки ультразвуком в ванне водой с температурой 20 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем разбавьте нанотрубки в концентрациях 0, 10, 20 и 50 микрограмм на миллилитр в полной среде, а затем инкубируйте по два миллилитра каждого раствора с интересующими клетками в планшете площадью 1 25 квадратного сантиметра на одно разведение при температуре 37 градусов Цельсия через 20 часов, удалите инкубационную среду с каждой пластины и промойте меченные углеродными нанотрубками клетки PBS.

После промывки трипсин просматривает клетки на каждой пластине, а затем повторно суспендирует их в полной среде DMEM. Далее переложите каждый образец в отдельные пробирки einor объемом 15 миллилитров, а затем раскрутите ячейки в течение пяти минут при температуре 200 G и комнатной температуре. Суспендируйте каждую гранулу в 4% параформальдегиде при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа.

После фиксации снова раскрутите клетки вниз и повторно суспендируйте каждый гранулированный образец в соотношении 15 умножить на 10 к пятой клетке в 150 микролитрах PBS. Затем отфильтруйте образцы через отдельные сетчатые фильтры размером 50 микрон, чтобы получить изображения клеток с помощью потока изображений. Проточный цитометр с мультиспектральной визуализацией.

Сначала выберите адаптированное увеличение, а затем изображение интересующих образцов. Используйте лазер с яркостью 685 нанометров для отображения темного поля и установите проточный цитометр. Канал номер шесть для сбора излучения темного поля в полосе от 745 до 800 нанометров.

Визуализируйте образцы в светлом поле номер один и канал номер шесть в темном поле для анализа изображения. Сначала создайте параметрическую точечную диаграмму с соотношением ширины и высоты к площади ячейки. Это позволяет различать одиночные клетки, которые имеют стандартную площадь и соотношение сторон, близкое к единице, от многоклеточных событий, которые имеют большую площадь и маленькое соотношение сторон, и обломков, которые демонстрируют чрезвычайно малую площадь.

После использования изображений ячеек для проверки правильности выбора отдельных ячеек настройте бипараметрическую точечную диаграмму для высококонтрастных ячеек, меченных углеродными нанотрубками, построив график контраста относительно среднеквадратичного градиента корня, чтобы исключить низкий корень, средний квадратичный градиент, низкоконтрастные несфокусированные клетки и выбрать ячейки в сфокусированной плоскости. Затем используйте инструмент поиска наилучшего объекта, чтобы определить параметр, обеспечивающий наилучшее статистическое разделение между помеченными и непомеченными ячейками. Например, для этого репрезентативного эксперимента наиболее подходящей является характеристика объекта в среднем пикселе.

Затем постройте график этого параметра относительно нормализованной частоты, чтобы проследить гистограмму для количественной оценки нанотрубок, занятых клетками при каждой экспериментальной концентрации. Теперь построим бипараметрический график для среднего пиксельного объекта в светлом поле в зависимости интенсивности от интенсивности в темном поле. Чтобы проверить корреляцию между этими двумя параметрами, количественная оценка нанотрубок также оценивается путем создания изображений на ячейке, поскольку углеродные нанотрубки проявляются в виде интенсивных темных пятен. Одна, которая точно подходит к темным нанотрубкам для создания второй маски, обозначена как Маска 2 для визуализации нанотрубок, которые кажутся яркими в канале темного поля.

Выберите диапазон пикселей с высокой интенсивностью. Например, для этого эксперимента был выбран диапазон от 150 до 4,095. Затем, используя область либо из первой маски светлого поля, либо из маски темного поля 2, установите точечную диаграмму для количественной оценки относительной интернализации нанотрубок.

Например, построите область на шестом канале, соответствующую темному полю с маской два, против области на первом канале, соответствующей светлому полю с маской один. После определения линейной корреляции между первой и второй масками визуализируйте нанотрубки в цитоплазме, сначала создав маску всей клетки, а затем разрушив маску. Теперь обозначается эрозия M 0 1 7 на семь пикселей для просмотра внутренней части ячейки.

Чтобы визуализировать углеродные нанотрубки внутри клеточной мембраны, используйте булево уравнение M zero one и не разрушайте M 0 1 7. То есть маска всей клетки, вычитается из внутренней части клетки для создания маски мембраны только для оценки темных пикселей на мембране. Нанесите светлопольную маску один на мембранную маску.

Примените все эти маски к нескольким ячейкам одновременно, чтобы подтвердить различие между помеченными и непомеченными образцами. Затем выделите черные пиксели на мембране с помощью инструмента «Область признаков» для количественного определения углеродных нанотрубок на клеточной мембране. Наконец, различать углеродные нанотрубки, которые были интернализованы, от тех, которые абсорбировались на мембране.

График, черная область мембраны на фоне черной области всей клетки. После того, как все графики созданы для одного экспериментального условия, создайте шаблон статистического отчета. Сохраните шаблон в виде файла A ST и объедините все файлы данных.

Устройство потока изображений создает несколько изображений с высоким разрешением каждой клетки в проточном цитометре, включая светлопольные, темные и флуоресцентные каналы, как показано здесь на примере трех различных клеток, меченных нанотрубками. Также показаны наложения этих каналов. Присутствие углеродных нанотрубок вызывает изменения как контраста, так и градиента меченых клеток по сравнению с немечеными клетками.

Таким образом, создание бипараметрической точечной диаграммы важно для выбора фокусных ячеек. Несфокусированные клетки, выделенные желтым цветом, могут быть различимы по их низкому контрасту и низкому среднеквадратичному градиенту независимо от наличия или отсутствия мечения нанотрубками. Немеченные фокусные клетки также демонстрируют низкий контраст, но демонстрируют высокий корневой, средний квадратичный градиент, когда фокусные клетки помечены нанотрубками, однако клетки демонстрируют высокий контрастный, низкокорневый, среднеквадратичный градиентный профиль.

Интернализованные углеродные нанотрубки легко различимы, особенно в канале Brightfield, где они проявляются в виде интенсивных темных пятен, площадь которых увеличивается с концентрацией нанотрубок. Когда анализируются средние пиксельные сигналы светлопольных изображений, можно определить относительную количественную оценку поглощения нанотрубками. Например, эти гистограммы демонстрируют значительное увеличение поглощения нанотрубками, которое происходит с каждым увеличением концентрации мечения нанотрубками, поскольку продемонстрировано, что количественное определение углеродных нанотрубок также возможно благодаря использованию масок, нанесенных либо на ограниченный диапазон темных пикселей в ярком поле, либо на пиксели высокой интенсивности в темном поле. соответствующие областям, где присутствуют нанотрубки.

Построение графика площади этих масок позволяет дополнительно количественно оценить поглощение углеродных нанотрубок. Кроме того, корреляцию между пятнами на изображениях светлого и темного полей можно оценить, построив график зависимости интенсивности темного поля от среднего сигнала пикселей светлого поля или построив график площади маски в светлом поле по отношению к области в темном поле. На следующих двух рисунках показан анализ углеродных нанотрубок, локализованных внутри клетки.

На этих первых изображениях показаны различные маски, которые были созданы. Обратите внимание, что надежность масок локализации на основе эрозии маски ячейки по умолчанию должна быть проверена визуально на основе коллекции помеченных и непомеченных ячеек. Как только что было показано на этих точечных графиках, общая площадь черных пятен на клеточной мембране по отношению ко всей клетке была построена для определения оценки интернализации.

Для клеток, которые инкубировались в течение 20 часов при 37 градусах Цельсия, по сравнению с клетками, которые инкубировались в течение двух часов при четырех градусах Цельсия при четырех градусах Цельсия, углеродные нанотрубки в основном расположены на мембране, в то время как при 37 градусах Цельсия углеродные нанотрубки интернализуются более чем в 90% клеток. Флуоресценция углеродных нанотрубок не является хорошим индикатором интернализации углеродных нанотрубок из-за слишком низкой корреляции между флуоресцентными пятнами и пятнами в каналах яркого и темного поля. Действительно, корреляция между интенсивностью фитзи и средним пикселем яркого поля указывает на коэффициент корреляции Пирсона, равный минус 0,2.

Как показано на этих изображениях, флуоресцентный сигнал ненадежно согласуется с черными пятнами яркого поля, углеродными нанотрубками, удержанием и агрегацией во внутриклеточных лизосомах, частично гасящими флуоресцентный сигнал. Напротив, дисперсные нанотрубки могут давать более надежный флуоресцентный сигнал после его разработки. Этот метод открывает исследователям в области нанотехнологий и наномедицины путь к изучению взаимодействия живых клеток с наноматериалами на основе углерода или любыми наноматериалами с высокой поглощающей способностью и способностью рассеивания жизни с помощью метода статистической высокопроизводительной цитометрии.