Сотовые смерти, связанной с аномальными митоза Наблюдаемые конфокальной микроскопии в живых клетках рака

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении цитотоксического эффекта производного филантра PJ 34 во время митоза в мультицентросомальных раковых клетках человека. Это достигается путем маркировки центросом с помощью GFP гамма-тубулина и хромосом с помощью H two B read посредством трансфекции. Целью трансфекции является возможность отслеживания миграции и кластеризации центросом, а также расположения хромосом во время митоза в живых мультицентросомальных раковых клетках.

На втором этапе часть трансфецированных клеток подвергают воздействию PJ 34 — молекулы, которая действует как агент по удалению лишних центросом. Затем живые трансфецированные раковые клетки сканируют с помощью конфокальной микроскопии для фиксации событий митоза, связанных с миграцией центросом и хромосом. Последовательные изображения, полученные при переупорядочивании или кластеризации, демонстрируют эффекты очистки и цитотоксическое действие PJ 34 в раковых клетках во время митоза на основе конфокальной визуализации живых клеток.

Значение данной методики заключается в возможности разработки таргетной терапии рака, направленной на избирательное уничтожение аутосомальных раковых клеток в during mitosis. Демонстрацию данной методики проведут наши коллеги: доктор Ашер Кастильо из Центра исследований рака Медицинского центра Шеба и доктор Леонид Миддлман из отделения визуализации Медицинского факультета имени Саккера Тель-Авивского университета. Для подготовки клеток рака молочной железы M-D-A-M-B 231 к живому конфокальному имиджингу высейте 2×10⁵ клеток в культуральные чашки с There glass bottom диаметром 35 мм, покрытые поли-D-лизином, в 2 мл полной среды; инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂.

Культура клеток готова к трансфекции при достижении конфлюэнтности от 60 до 70%. Клетки будут трансфицированы двумя плазмидами: одна кодирует гамма-тубулин, GFP для флуоресцентного детектирования центросом, а другая — красный гистон для флуоресцентного детектирования хромосом. Трансфекция проводится с использованием липосомального реагента для трансфекции jet PI в соответствии с протоколом производителя. Один раз промойте клетки PBS, затем замените питательную среду на 2 мл подогретого DMEM без добавок. Осторожно добавьте смесь для трансфекции к клеткам в среде DMEM и верните клетки в инкубатор на восемь часов. Через восемь часов

Замените DMEM на два миллилитра полной среды и инкубируйте клетки в инкубаторе в течение 24 часов. После трансфекции замените среду на два миллилитра полной среды, содержащей 20 µM PGA 34.

Инкубируйте клетки еще в течение 18 часов перед проведением конфокальной микроскопии живых клеток. Ниже приведены технические параметры настроек сканера для конфокальной микроскопии живых клеток. Режим сканирования XYZT, диафрагма (pinhole) — 1.00 airy, увеличение 3.5, разрешение восемь бит, лазеры: DPSS 561 nanometers, аргоновый видимый лазер 488 nanometers, гелий-неоновый видимый лазер 633 nanometers.

Объектив H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63x 1.40 Oil UV с числовой апертурой 1.4. Скорость сканирования 700 hertz, показатель преломления 1.52. Проводите конфокальную визуализацию живых клеток в течение не менее 16 часов в специальной камере, поддерживая содержание carbon dioxide на уровне 5% и температуру 37 °C.

Эффективность трансфекции будет изучена с помощью флуоресцентной микроскопии. Начните процедуру с высева 2 × 10⁵ клеток MDA MB 231 в шестилуночный планшет, содержащий по одному покровному стеклу на лунку, в 2 мл полной среды. Трансфектируйте клетки аналогичным образом, как и ранее, используя липосомальный реагент для трансфекции jet PI в соответствии с протоколом производителя.

Через 36 часов после трансфекции. Удалите среду из каждой лунки после промывки трансфецированных клеток, закрепленных на покровном стекле, с помощью PBS. Зафиксируйте клетки, инкубируя их в холодном растворе метанола и ацетона в соотношении один к одному в течение семи минут при температуре -20 °C.

Спустя семь минут аспирируйте фиксирующий раствор и дайте предметному стеклу с закрепленными клетками высохнуть в вытяжном шкафу в течение 30 минут. Затем нанесите реагент против выцветания Prolonged Gold с DPI и оставьте предметное стекло сохнуть в темноте на шесть часов. Изучите препарат под флуоресцентным микроскопом и рассчитайте процент трансфицированных клеток с красным и зеленым сигналами.

Из общей популяции клеток желаемый процент трансфекции составляет примерно 20–40% при подсчете 100–200 клеток. Для начала этой процедуры посейте 2 × 10⁵ клеток рака молочной железы MDA-MB-231 на покровные стекла в шестилуночном планшете в 2 мл полной среды. Добавьте PJ 34 в среду и инкубируйте клетки в течение необходимого периода.

По завершении периода инкубации один раз промойте покровные стекла раствором PBS и зафиксируйте клетки, инкубируя их в течение семи минут при -20 °C в смеси ледяного метанола и ацетона в соотношении один к одному. Затем аспирируйте фиксирующий раствор и дайте покровным стеклам высохнуть в вытяжном шкафу в течение 30 минут. Один раз промойте покровные стекла раствором PBST для пермеабилизации клеточных мембран, после чего заблокируйте клетки, инкубируя их в 10% нормальной сыворотке осла в PBST в течение одного часа при комнатной температуре.

Приготовьте первую смесь антител, добавив первичные антитела к α-тубулину и γ-тубулину в блокирующий раствор, и перемешайте на вортексе. Затем нанесите по 100 µL смеси антител на каждое покровное стекло на крышке шестилуночного планшета. Переверните покровное стекло и осторожно поместите его на каплю антител; инкубируйте в течение двух часов.

Выдержите при комнатной температуре. Это позволит окрасить веретена деления и центросомы. Верните покровные стекла в лунки и трижды промойте клетки раствором PBST.

Затем нанесите вторичные антитела, LOR 488 и LOR 568, по одной капле на каждое покровное стекло на крышку планшета с шестью лунками. Поместите покровные стекла лицевой стороной вниз на капли антител и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. По завершении инкубации с вторичными антителами верните покровные стекла в лунки и трижды промойте клетки раствором PBST.

Наконец, закройте препараты покровными стеклами, используя антифейдинговый реагент Prolong Gold, и инкубируйте их в течение ночи при комнатной температуре в темноте для высыхания перед визуализацией фиксированных клеток с помощью конфокальной микроскопии. PJ 34 представляет собой стабильный водорастворимый производный парсамексина, который, как было замечено ранее, избирательно уничтожает раковые клетки с множественными центросомами, не повреждая нормальные клетки, проходящие митоз с двумя центросомами и биполярными веретенами деления. В данном исследовании цитотоксическая активность PJ 34 была изучена на живых клетках рака молочной железы человека MDA-MB-231, характеризующихся высокой частотой появления дополнительных центросом.

Клетки были трансфецированы GFP-гамма-тубулином для маркировки фокусов гамма-тубулина и красным гистоном H2B для маркировки хромосом. Сканирование клеток MDA-MB-231 с помощью конфокальной микроскопии в течение не менее 16 часов выявило бифокальную кластеризацию центросом, представляющую собой бифокальную кластеризацию дополнительных центросом в большинстве клеток в митозе, что показано в следующих видеоклипах. На первом видео представлена случайно выбранная живая клетка во время митоза, в которой центросомы окрашены в зеленый цвет с помощью гамма-тубулина.

GFP во втором видео позволяет визуализировать перестройку хромосом во время митоза в случайно выбранной клетке M-D-A-M-B 231, трансфектированной гистоном H two B red. Это третье видео демонстрирует клетку MDA MB 231, проходящую через митоз, где бифокальные кластерные очаги экстрарисом помечены зеленым, а хромосомы — красным. Напротив, некластерные центросомы и аберрантное расположение хромосом были обнаружены в живых трансфектированных клетках M-D-A-M-B 231, инкубированных с 20 micromolar PJ 34; митоз в этих клетках завершился гибелью клетки, как показано в данном фильме.

Данная регистрация гибели клеток в режиме реального времени во время митоза убедительно подтверждает ранее определенную положительную корреляцию между количеством злокачественных клеток человека с многополюсными веретенами деления в митозе и процентом гибели клеток при инкубации с PJ 34. Поскольку PJ 34 действует как мощный ингибитор PARP one, была исследована возможность того, что ингибирование PARP one вызывает гибель клеток, связанную с нарушением митоза. Цитотоксическая активность возрастающих концентраций PJ 34 была протестирована на нормальных и дефицитных по PARP one эмбриональных фибробластах мыши, и результаты представлены здесь.

На графике слева показан процент мультифокальных веретен, рассчитанный для нормальных эмбриональных фибробластов мыши (черная линия) и фибробластов с дефицитом PARP1 (серая линия), инкубированных в течение 48 часов с PJ 34 в указанных концентрациях. Эти значения были рассчитаны на основе общего количества из 20 обнаруженных веретен в трех различных экспериментах. На графике справа показана выживаемость нормальных эмбриональных фибробластов мыши и фибробластов с дефицитом PARP1, инкубированных в течение 72 часов с 20 µM.

Выживаемость клеток PJ 34 оценивали по продукции ATP в клетках. Представлены средние значения четырех измерений для каждой клеточной линии в трех различных экспериментах. Эти результаты показывают, что PJ 34 дозозависимым образом вызывал деформацию веретен деления и гибель клеток в эмбриональных фибробластах мыши с дефицитом PARP one, но не в нормальных фибробластах.

Тот факт, что PJ 34 вызывал эрадикацию клеток с дефицитом PARP1, несмотря на их дефицит по PARP1, а также корреляция между образованием мультифокальных веретен и эрадикацией клеток в эмбриональных фибробластах мыши с дефицитом PARP1 при инкубации с PJ 34 в концентрациях, превышающих необходимые для ингибирования PARP1, не подтверждают наличие причинно-следственной связи между очисткой центросом в эмбриональных фибробластах мыши с дефицитом PARP1 и ингибированием PARP1. На данных конфокальных изображениях представлены нормальные эмбриональные фибробласты мыши и фибробласты с дефицитом PARP1 в состоянии митоза; клетки были фиксированы, пермеабилизированы и иммуномаркированы на альфа- и гамма-тубулин, которые окрасили веретена деления в зеленый цвет, а центросомы — в красный соответственно. Хромосомы были окрашены в синий цвет с помощью реагента DPI.

Клетки либо оставались необработанными, либо инкубировались с PJ 34 в течение 48 часов при указанных концентрациях. Некластеризованные фокусы гамма-тубулина, искажение веретен деления и гибель клеток наблюдались в эмбриональных фибробластах мыши с дефицитом PARP 1, обработанных PJ 34, но не в нормальных эмбриональных фибробластах мыши, обработанных PJ 34. Некоторые из исследуемых клеточных культур обрабатывали двумя мощными неникотинамидными ингибиторами PARP 1 — BT 8 88 и G 0 1 4 6 9, которые подавляют ферментативную активность PARP 1.

Ни один из протестированных ингибиторов PARP one не оказал негативного влияния на нормальные эмбриональные фибробласты мыши в концентрациях, ингибирующих активность PARP one. Эти ингибиторы PARP one также не повлияли на кластеризацию центросом в эмбриональных фибробластах мыши с дефицитом PARP one. Данные результаты указывают на то, что цитотоксическое действие PJ 34 на клетки с множественными центросомами не характерно для других мощных ингибиторов PARP one.

Этот метод может быть использован и на других типах живых клеток для различных целей.