Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

Общая цель данной процедуры заключается в выделении стволовых клеток из жировой ткани, полученной в виде липоаспирата. Это достигается путем предварительного удаления хирургического раствора и промывки аспирата для очистки от contaminating red blood cells. На втором этапе стволовые клетки высвобождаются путем ферментативного переваривания промытого липоаспирата с помощью коллагеназы.

Затем высвобожденные клетки в виде стромально-васкулярной фракции (SVF) собирают путем центрифугирования. На заключительном этапе супернатант удаляют, а клетки SVF высевают на планшет для селекции и культивирования адгезивных ASC. В конечном итоге проводят индукцию этих культивируемых ASC in vitro в направлении костной, жировой и хрящевой тканей.

Линейки могут быть использованы для подтверждения наличия этих клеток в культуре, а также для подтверждения их мультипотентности. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за логистики работы с большими объемами липоаспирина перед сбором клеток. Приготовьте стерильный раствор коллагеназы 1 типа и стерильную контрольную среду.

Соберите липоаспират в контейнер для аспирации. Осторожно перелейте липоаспират в стерильный стеклянный стакан объемом один литр. После того как слои липоаспирата разделятся под действием силы тяжести, удалите верхний слой жира, если он имеется.

Также удалите нижний инактивированный слой. Оцените объем получившегося слоя жировой ткани. Добавьте равный объем стерильного 1x PBS и перемешайте с помощью пипетки, использовавшейся для аспирации.

После разделения на два слоя удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Продолжайте промывать фракцию жировой ткани раствором PBS до тех пор, пока жировой слой не приобретет желто-золотистый цвет. Удалите надосадочную жидкость в последний раз, оставив фракцию жировой ткани.

В стеклянном стакане. Дайте слоям липоаспирата отстояться в течение пяти минут после последнего промывания и перед финальным аспирированием. В фильтрующем устройстве приготовьте стерильный раствор коллагеназы 1.

Добавьте объем, равный объему жировой фракции, и профильтруйте через стерильный фильтр. Затем осторожно перелейте промытую жировую фракцию в раствор коллагеназы и плотно закройте флакон. Инкубируйте смесь жировой ткани с коллагеназой в водяной бане при 37 °C в течение 30 минут, осторожно перемешивая каждые 5–10 минут; по мере протекания переваривания оценивайте слой жировой ткани на предмет более однородного вида и, при необходимости, увеличьте время реакции до полного растворения твердых фрагментов жира.

Стерилизуйте фильтрующий блок, содержащий переваренную смесь жировой ткани с коллагеназой, 70% этанолом и верните его в шкаф биологической безопасности. Теперь перенесите аликвоты по 25 milliliter супернатанта, содержащего стромально-васкулярную фракцию, в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 milliliter. Добавьте в каждую пробирку 25 milliliters контрольной среды и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут для инактивации коллагеназы.

Затем центрифугируйте пробу в течение 10 минут при 1 200 ×g в шкафу биологической безопасности, чтобы осадить стромально-васкулярную фракцию. Аспирируйте супернадант из каждой пробирки. Убедитесь, что верхний слой масла и любые плавающие адипоциты удалены вместе с этим супернадантом.

Затем объедините осадки SVF в одной центрифужной пробирке, используя 30 миллилитров кондиционированной среды, и разделите поровну между двумя новыми центрифужными пробирками объемом 50 миллилитров; после центрифугирования аспирируйте супернатанты с обоих осадков. Если требуется лизис эритроцитов, каждый из этих двух осадков можно ресуспендировать в 10 миллилитрах буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугирования аспирируйте супернатанты, чтобы получить осадки стромальной васкулярной фракции.

Объедините эти два осадка в одну новую центрифужную пробирку. С помощью 5–10 мл контрольной среды крупные частицы ткани можно отфильтровать, используя фильтр с размером пор 100 микрон, помещенный на новую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Теперь разлейте отфильтрованную фракцию, содержащую жировые стволовые клетки, по чашкам для культивирования тканей.

Затем дополните каждую чашку соответствующим объемом контрольной питательной среды. Культивируйте клетки в течение трех-четырех дней без замены среды, после чего аспирируйте культуральную среду и один раз промойте клетки стерильным PBS для удаления contaminating red blood cells, затем снова добавьте среду и продолжайте культивирование. При использовании данного метода ферментативного выделения стромально-васкулярной фракции из большого объема образца липоаспирата.

Полученная культура популяции A SC относительно однородна по виду и состоит из фибробластоподобных клеток, что является наиболее распространенным способом подтверждения. Индукция популяции A SC in vitro с использованием определенных условий культивирования приводит к их дифференцировке в мезодермальные, эктодермальные и энтодермальные линии. Способность к формированию трех зародышевых листков in vitro позволила использовать ASC в широком спектре регенеративных модельных систем.

Дифференцировки в адипогенные, остеогенные и хондрогенные клетки обычно достаточно для идентификации ASC и подтверждения ее мультипотентности. Кроме того, ASC могут дифференцироваться в клетки скелетно-мышечной и гладкомышечной линий, клетки эктодермальной линии или клетки печени энтодермальной линии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделить стромально-васкулярную фракцию из липосанкции.

С точки зрения Тьюринга, это компонент SC.