Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

Общая цель данной процедуры заключается в выделении и маркировке нейтрофилов из костного мозга мыши для последующих функциональных исследований и экспериментов по адаптивному переносу. Это достигается путем первоначального сбора клеток костного мозга из бедренных и большеберцовых костей мышей. На втором этапе эритроциты подвергаются осмотическому лизису путем последовательного суспендирования в 0.2% и 1.6% растворах sodium chloride соответственно.

Затем нейтрофилы изолируют методом центрифугирования в градиенте плотности. На заключительном этапе нейтрофилы маркируют красителями для отслеживания клеток. В итоге с помощью проточной цитометрии можно определить количество адаптивно перенесенных нейтрофилов, мигрировавших в различные ткани мыши.

Основным преимуществом выделения нейтрофилов мыши из костного мозга по сравнению с кровью или перитонеальной жидкостью является то, что из костного мозга как в стационарном состоянии, так и после инфекции можно получить большое количество клеток, достаточное для последующих функциональных исследований и экспериментов по адаптивному переносу. Преимущество использования метода градиентного центрифугирования для выделения нейтрофилов мыши перед иммуномагнитным отбором или сортингом клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного анализа заключается в том, что этот метод является быстрым, экономичным и позволяет избежать маркировки нейтрофилов антителами, которые могут индуцировать их активацию. Процедуру продемонстрирует Мука Свами, техник моей лаборатории, после обработки эвтаназированной мыши 70% ethanol.

Сделайте разрез кожи животного в области средней части живота, затем удалите кожный покров с дистальной части тела животного, включая нижние конечности. Затем с помощью ножниц рассеките мышцы задних конечностей животного и аккуратно вывихните ACE beum из тазобедренного сустава, стараясь не повредить головку бедренной кости. После этого с помощью ножниц и скальпеля удалите оставшиеся мышцы с бедренной и большеберцовой костей.

Разделите кости конечностей в области коленного сустава, стараясь не повредить концы костей, затем поместите кости в чашку Петри с ледяным RPMI 1640. Добавьте FBS и антибиотики. Перенесите чашку в ламинарный шкаф для культивирования тканей, после чего стерилизуйте внешнюю поверхность каждой кости 70% этанолом в новой чашке Петри.

Примерно через 10–15 секунд удалите этанол с поверхности каждой кости, промыв их трижды ледяным стерильным раствором PBS. Затем отсеките эпифиз каждой кости и поместите его в новую стерильную чашку Петри. Далее прикрепите иглу 25-го калибра к шприцу объемом 12 cc, заполненному 10 миллилитрами среды RPMI.

Добавьте FBS и EDTA. Затем вымойте клетки костного мозга с обоих концов диафиза каждой пары бедренной и большеберцовой костей в пробирку Falcon объемом 50 мл с завинчивающейся крышкой, оснащенную фильтром 100 мкм, чтобы собрать все клетки. Соскребите внутренние поверхности костей кончиком иглы.

Когда кости станут обесцвеченными, это будет означать, что клетки удалены в достаточном объеме. Теперь с помощью скальпеля разрежьте эпифизы костей на небольшие кусочки размером от 0.5 до 1 мм, затем с помощью тупого конца наконечника BioPure для дозатора объемом 2.5 мл раздавите их через фильтр 100 µm. После центрифугирования собранных клеток в течение семи минут при 427 ×g и 4 °C промойте эритроциты в 20 мл 0.2% sodium chloride в течение примерно 20 секунд.

Затем остановите лизис, добавив 20 миллилитров 1,6% раствора хлорида натрия, центрифугируйте клетки, после чего ресуспендируйте осадок в среде RPMI 1640 с добавлением FBS и EDTA. Подсчитайте количество клеток, и после повторного центрифугирования ресуспендируйте промытый осадок в ледяном стерильном PBS в концентрации не более 100 × 10⁶ клеток на 1 миллилитр. Теперь внесите 3 миллилитра раствора His-opaque 1119 при температуре 18–26 °C в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, а затем медленно наслоите 3 миллилитра раствора при температуре 18–26 °C.

Используйте Ficoll 1 0 7 7. Чтобы избежать перемешивания двух плотностей сразу после подготовки, осторожно нанесите суспензию клеток костного мозга поверх слоя Ficoll 1 0 7 7. Центрифугируйте градиент плотности в течение 30 минут при 834 ×g и 25 °C без торможения, затем соберите нейтрофилы на границе слоев Ficoll 1 1 1 9 и 1 0 7 7. После двукратного промывания собранных нейтрофилов в RPMI 1 6 4 0 с FBS и антибиотиками, ресуспендируйте клетки в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл в PBS, предварительно нагретом до 37 °C.

После подсчета клеток отберите небольшую аликвоту каждого экспериментального образца для определения чистоты и жизнеспособности с помощью проточной цитометрии, а затем окрасьте оставшиеся нейтрофилы красителем CellTracker в конечной концентрации 5 µM в течение 10 минут при 37 °C в шейкере с водяной баней в темноте. Наконец, дважды промойте клетки ледяным RPMI 1640 с добавлением FBS и антибиотиков, чтобы избежать перекрестного загрязнения красителем, перед смешиванием дифференциально меченных популяций нейтрофилов для последующих исследований конкурентного заселения; на данной панели представлены репрезентативные графики проточной цитометрии нейтрофилов, выделенных из костного мозга с помощью разделения по градиенту плотности от неинфицированной мыши C57BL/6. Начальный гейтинг использовался для клеток костного мозга, собранных с границы раздела Histopaque 1119 и Histopaque 1077.

С помощью анализа прямого и бокового светорассеяния показано, что нейтрофилы, разделенные методом градиента плотности, имеют чистоту более 90% и жизнеспособность более 95% в течение как минимум четырех часов после адаптивного переноса. Нейтрофилы, меченные трекером клеток DIA, можно отслеживать с помощью проточной цитометрии в различных тканях мыши. Например, в крови, костном мозге и почках реципиента — мыши линии C57BL/6, инфицированной Candida, что показано в данном эксперименте — путем выделения гейтом живых CD45+ Ly6G+ CD11b+ клеток, данные репрезентативные адаптивно перенесенные нейтрофилы, меченные CMTMR, могут быть дифференцированы от собственных CMTMR- и PE-отрицательных нейтрофилов мыши-реципиента по экспрессии PE.

После освоения методики выделение и маркировку нейтрофилов костного мозга мыши можно выполнить за три часа.