Генетически-кодированные Молекулярные зонды по изучению G-белком

Общая цель следующего эксперимента заключается во внедрении одного информативного зонда в целевые рецепторы, сопряженные с G-белком, для облегчения структурных и динамических исследований сигнальных комплексов. Это достигается путем трансфекции клеток плазмидами, необходимыми для экспрессии трансляционного аппарата, который позволяет включить ненатуральную аминокислоту zeto, фенилаланин или zeto fee в экспрессируемый GPCR. Вариант GPCR zeto fee затем может быть применен тремя различными способами для исследования структуры и функции рецептора.

Во-первых, zeto fee используется в качестве фотоактивируемого кросслинкера в GPCR, что позволяет идентифицировать сайт связывания тритированного лиганда. Затем zeto fee может быть использован в качестве реакционной химической группы для присоединения конъюгированного пептида или флуоресцентного зонда к GPCR с помощью методов биоортогонального мечения; полученные результаты демонстрируют применение молекулярного зонда zeto fee для направленного фотокросслинкинга, направленного мечения эпитопов и флуоресцентного мечения GPCR с использованием методов биохимического анализа и анализа живых клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как использование фотоаффинных лигандов или мечение по цистеину, является возможность сайт-специфического введения биологически инертной и реакционноспособной ненатуральной аминокислоты P zeto phenol alanine в известную позицию целевого рецептора.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигналинга GPCR, включая картирование сайтов взаимодействия в комплексе рецептора с лигандом в нативной мембранной среде, а также облегчить проведение флуоресцентных исследований отдельных молекул путем идентификации позиций в GPCR, пригодных для биоортогонального мечения. Кроме того, данный метод может дать представление о молекулярном механизме рецепторов, сопряженных с G-белком, и может быть применен к другим системам, таким как различные клеточные и мембранные белки. Перед началом данного эксперимента поддерживайте культуру клеток HEK 293T в модифицированной среде Eagle (KO), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, при 37 °C в атмосфере с 5% CO2.

Трансфицируйте клетки при 60–80% конфлюэнтности в 10-сантиметровой чашке с G pcr, r CD, NA, используя реагент Lipectomy Plus, как описано в текстовом протоколе. На следующий день замените ростовую среду на DMEM, содержащую 10% FBS и 0,5 мМ fee. Через 48 часов после трансфекции проанализируйте экспрессию согласно описанию в тексте.

Перейдите к процедурам фотографирования, кросс-линкинга или мечения, как описано далее в этом видео. Через 48 часов после трансфекции аспирируйте среду из лунок и замените ее четырьмя миллилитрами 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Выдержите при 37 °C в течение 15 минут, чтобы клетки отделились от поверхности планшета. Затем ресуспендируйте клетки в 1x PBS и перенесите в пробирку Falcon, центрифугируя при 1500 об/мин в течение двух минут.

Для получения осадка клеток аспирируйте супернатант, затем ресуспендируйте осадок клеток в одномкратном растворе сбалансированной соли Хэнкса, содержащем тритиевым лигандом в насыщающей концентрации связывания, приготовленном согласно описанному в текстовом протоколе методу. Инкубируйте осадок при 37 °C в течение необходимого времени для обеспечения формирования комплекса рецептор-лиганд, которое зависит от конкретного рецептора и лиганда. Затем перенесите клеточную суспензию в 24- или 96-луночный планшет.

Затем проведите фотоактивацию zeptofee с помощью ультрафиолетовой лампы с длиной волны 365 нм в течение 15 минут при температуре 4 °C, поддерживая планшет на льду, чтобы избежать нагрева образцов и лизиса клеток. После фотоактивации перенесите клетки в пробирку Eppendorf и центрифугируйте для осаждения клеток. Удалите супернатант и перейдите к анализу.

Ресуспендируйте клеточный осадок в лизирующем буфере и инкубируйте клетки в течение одного часа при 4 °C. Затем центрифугируйте клеточный лизат в течение 10 минут при 16 000 ×g. Перед переносом супернатанта в новую пробирку добавьте в супернатант модифицированные моноклональными антителами 1D4 SROs 2B-смолы и инкубируйте в течение ночи при 4 °C для иммуноочистки GPCR с использованием сконструированного эпитопа моноклональных антител 1D4 на C-конце. На следующий день несколько раз промойте гранулы лизирующим буфером. Элюируйте образцы 1% SDS при 37 °C в течение одного часа при перемешивании.

Перенесите часть EENT в виалу объемом 15 миллилитров, содержащую сцинтилляционную жидкость, и измерьте активность на бета-сцинтилляционном счетчике для количественного определения специфического связывания тритированного лиганда с рецептором. Оставшуюся очищенную фракцию EENT раздеleyin с помощью стандартного гель-электрофореза, используя 4–12% SDS-гель и стандартный маркер белков. Затем проведите полусухой перенос на мембрану A-P-V-D-F для иммуноблоттинга.

Блокируйте мембрану из PVDF 5% раствором молока в буфере TBS, содержащем 0,05% Tween 20. Проведите зондирование мембраны для подтверждения экспрессии полноразмерного рецептора с помощью моноклонального антитела 1D, после чего используйте вторичное антитело anti-US IgG, конъюгированное с HRP. Затем обработайте мембрану реагентом для усиленной хемолюминесценции.

Экспонируйте мембрану на авторадиографическую пленку для визуализации полос. Затем с помощью лезвия бритвы разрежьте мембрану, чтобы разделить дорожки каждого образца, и сделайте разрезы по соответствующим маркерам молекулярной массы. Перенесите сегменты мембраны в пробирки со сцинтилляционной жидкостью, после чего количественно определите содержание трития в каждом сегменте мембраны с помощью бета-сцинтилляционного счетчика.

Идентифицируйте положительное фотоперекрестное сшивание по обнаружению трития при кажущейся молекулярной массе, равной сумме масс GPCR и лиганда. После промывки и подсчета клеток предварительно обработайте 96-луночный планшет с высокой сорбционной способностью и прозрачным дном, добавив в каждую лунку 100 µL поли-D-лизина в концентрации 10 µg/mL; инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.

Затем несколько раз промойте 1xPBS, после чего дайте планшету высохнуть на воздухе, и высейте трансфецированные клетки в объеме 200 мкл с плотностью 60–80 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет и верните их при 37 °C в атмосферу с 5% CO2. На следующий день.

Подготовьте клетки к маркировке. Осторожно промойте клетки трижды, используя 100 µL XPBS на лунку, чтобы удалить остатки ростовой среды, содержащей сывороточный заменитель. Приготовьте буфер, содержащий от 50 до 200 µM маркирующего реагента flag Tri AAL PHOSPHINE, как описано в текстовом протоколе.

Внесите по 60 µL в каждую лунку. Оставьте группу лунок без обработки меткой и буфером. Также включите контрольный образец GPCR дикого типа для сравнения с вариантом GPCR с zeto-фидом.

Верните планшет при температуре 37 °C на период от 30 минут до четырех часов после инкубации. Промойте клетки трижды, используя по 100 µL на лунку блокирующего буфера, чтобы полностью удалить нереагирующую метку. Затем добавьте к клеткам по 100 µL на лунку 4% параформальдегида и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.

Промойте клетки трижды блокирующим буфером. Выполните стандартный протокол EISA для анализа поверхности клеток с целью обнаружения меченого рецептора и экспрессии рецептора, предварительно инкубировав клетки с первичными антителами в течение 1,5 часов на льду. Затем проведите инкубацию со вторичными антителами при комнатной температуре в течение одного часа.

Затем добавьте 100 µL разведенных антител Anti-Flag M two для детектирования флаг-пептидного эпитопа реагента для фосфинового мечения flag. Tri AAL. Также исследуйте лунки, не подвергавшиеся мечению, в качестве отрицательного контроля.

Затем добавьте разведенные антитела к CCR5 2D7 в отдельные группы лунок для определения экспрессии GPCR на поверхности клеток дикого типа или zeto fee. Промойте клетки трижды блокирующим буфером и инкубируйте с 100 µL разведенных антител к IgG мыши (anti-US IgG), конъюгированных с HRP.

После тщательной пятикратной промывки клеток блокирующим буфером добавьте 50 µL детекционного буфера и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Наконец, соберите спектральные данные с помощью многолуночного флуоресцентного планшетного ридера при длине волны возбуждения 530 нм и длине волны эмиссии 590 нм. Начните процедуру маркировки с лизиса 10 миллионов собранных клеток, экспрессирующих дикий тип или zeto fee.

Инкубируйте родопсина в одном миллилитре буфера для сольватации в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия. Соберите супернатант после центрифугирования клеточного лизата при 15 000 ×g в течение 10 минут. Затем добавьте 100 µL смолы 1D4 monoclonal antibody modified spheros 2 B для захвата рецептора с помощью модифицированного C-концевого эпитопа 1D4.

После инкубации в течение 12 часов при температуре 4 °C промойте смолу трижды, как описано в текстовом протоколе. Затем проведите мечение рецептора, иммобилизованного на иммуноаффинной матрице, добавив 0,1 мМ флуоресцеинового фосфина до общего объема 0,3–0,5 мл; инкубируйте в течение 12 часов при комнатной температуре, после чего удалите супернатант и центрифугируйте. Промойте смолу для удаления нереагировавшей метки; элюируйте меченый рецептор 100 мкл элюирующего буфера путем инкубации на льду в течение одного часа.

Разделите меченые образцы методом SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Перед проведением мечения GPCR методом флуоресценции In-gel кратко промойте гели в PBS, затем используйте конфокальный флуоресцентный сканер с лазером с длиной волны 488 нм для обнаружения рецепторов, модифицированных флуоресцеином.

Методика мутагенеза с использованием неестественных аминокислот была применена для сайт-специфического введения молекулярных зондов в A-G-P-C-R с помощью технологии супрессии амбер-кодона. Затем метод фотокросслинкинга может быть использован для исследования структурных аспектов комплексов лиганд-GPCR в живых клетках; для идентификации сайта связывания на G-P-C-R-C-C-R five использовался тритированный радиоактивно меченный низкомолекулярный лиганд Ravi Rock.

В данном примере УФ-облучение клеток, экспрессирующих zeto fee. CCR five variance, предварительно инкубированных с тритиевым Ravi. Rock, приводит к образованию ковалентно сшитых комплексов, которые могут быть идентифицированы с помощью чувствительной радиоактивной метки на лиганде.

Среди нескольких позиций в CCR5 протестированные лейцин 28 ze-to-fee и триптофан 86 ze-to-fee смогли образовать фотосвязи с тритированным Ravi Rock, что выразилось в значительно более высоких показателях сцинтилляционного счета. Рецептор дикого типа не проявил способности к образованию связей с радиоактивным лигандом. Химия биоортогонального мечения может быть использована для сайт-специфической модификации ze-to-feed.

Одна из стратегий анализа вариабельности GPCR включает направленное мечение эпитопов A-G-P-C-R в живых клетках с использованием конъюгированного с пептидом флаг-пептидного маркера. Реагент для мечения Tri AAL PHOSPHINE используется для специфической и селективной модификации zeto fee. Представленные здесь данные вариабельности CCR five являются репрезентативными данными чувствительной многоэтапной стратегии детекции EISA, используемой для идентификации позиций, меченных флаг-пептидом.

Среди позиций в CCR5 были исследованы все zeto fees. Варианты CCR5 экспрессировались на поверхности клеток, и примерно половина из них успешно подверглась направленному мечению эпитопов; CCR5 дикого типа служил отрицательным контролем мечения эпитопов, что подтверждалось отсутствием сигнала Anti-Flag. В качестве альтернативной стратегии zeto feed G PCR, солюбилизированные детергентом, были иммобилизованы на иммуноаффинной матрице, такой как моноклональное антитело anti 1D four, конъюгированное со смолой Spheros two B, и помечены флуорохромной меткой fluoro four.

Изображение флуоресценции Ingel демонстрирует успешное флуоресцентное мечение опсина GPCR в трех различных позициях, как и ожидалось; опсин дикого типа не показал фонового мечения, о чем свидетельствует отсутствие флуоресцентной полосы на уровне ожидаемой молекулярной массы рецептора. При выполнении данной процедуры важно не забыть подтвердить полную экспрессию целевого GPCR в хрусталике с помощью специфически введенной кислоты AOL Alanine после ее разработки.

Данный метод откроет исследователям в области биологии рецепторов возможность изучать любые комплексы рецептор-лиганд или маркировать целевой рецептор. В качестве реактивного зонда используется специфически введенная в определенный сайт ненатуральная аминокислота p-зетофенолаланин. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать неогенез ненатуральных аминокислот для введения молекулярного зонда в GPCR, чтобы облегчить структурные и динамические исследования сигнальных комплексов GPCR с помощью методов направленного фотокросслинкинга и биоортогонального мечения.