Протеомный Подготовка образцов из фиксированных формалином и залитых парафином ткани

Общая цель этой процедуры заключается в получении и предварительном фракционировании пептидов из формального и фиксированного и залитого парафином материала или материала FFPE для протеомного анализа. Это достигается путем выделения нужной ткани путем микродиссекции с последующим лизисом клеток. Второй шаг заключается в получении пептидов путем обработки образцов.

Использование мультиферментного фильтра для разложения помогло подготовке образцов. Затем пептиды количественно оцениваются путем измерения их флуоресценции тритофана. Заключительным этапом является фракционирование пептидов с использованием метода разделения пептидов на основе сильного анионита.

В конечном счете, подготовленные образцы позволяют анализировать протеомы от мельчайших количеств материала до глубины 10 000 белков. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как расщепление геля или раствора, заключается в том, что она применима к мельчайшим количествам клинических образцов, таких как лазерная микродиссекция клеток. Метод позволяет получить образцы, содержащие идеальные и чистые пептиды.

Что способствует протеомному исследованию тканей и заболеваний человека? Весь протокол состоит из методик, разработанных и опубликованных в прошлом. К ним относятся фасп с высоким уровнем восстановления, кончик пипета и определение содержания пептидов на основе флуоресценции триптофана, демонстрируя, что процедура будет проведена г-жой

Катина техником из нашей лаборатории, чтобы начать подготовку срезов ткани для микродиссекции среза с микротомом. Толщина ломтиков зависит от образца. Обычно микродиссекция хорошо работает со срезами размером от 7 до 10 микрометров.

Облучая мембранные предметные стекла ультрафиолетовым светом в течение 45 минут, смонтируйте на них секции перед сушкой при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Смонтированные секции депарируют двумя последовательными инкубациями в последовательных банках с ксилолом в течение двух с половиной минут и полутора минут. Затем последовательно увлажните секции.

Одноминутная инкубация в абсолютном этаноле, 70% этаноле. И, наконец, вода. После окрашивания участков гематином Мейера в течение 20 секунд.

Промойте водой в течение одной минуты и дайте высохнуть на воздухе. Соберите интересующую популяцию клеток с помощью системы микродиссекции с лазерным захватом. При использовании инструмента «Ладонь» соберите образцы в адгезивные колпачки, используя три микролитра буфера для лизиса тканей на 10 нанолитров микродиссективной ткани.

Нанесите буфер на микрорассеченный материал в колпачке и закройте пробирку. Соберите суспензию после короткого центрифугирования. Затем влагу микро рассекают ткани при температуре 99 градусов Цельсия в нагревательном блоке с перемешиванием в течение одного часа.

Осветите сырой экстракт центрифугированием при 16 000 G и 18 градусах Цельсия в течение 10 минут. Смешайте до 50 микролитров осветленного лизата с 200 микролитрами раствора UA в установке ультрафильтрации. Затем центрифугируйте при давлении 14 000 GS до тех пор, пока в фильтре не останется менее 10 микролитров раствора.

Обычно на этом этапе требуется от 10 до 15 минут центрифугирования. Далее пипеткой 200 микролитров раствора UA подается в установку ультрафильтрации и центрифугу. Как и раньше, опорожните сборную пробирку перед дозированием 50 микролитров раствора I A A в установку ультрафильтрации.

Перемешайте при 600 об/мин в термомиксере при комнатной температуре в течение одной минуты и центрифугируйте. Как и раньше, продолжайте этапы ультрафильтрации и центрифугирования, как описано в текстовом протоколе, прилагаемом к этому видео. Затем переложите фильтрующие установки в новые сборные пробирки.

Пипетку 40 микролитров буфера для пищеварения с эндопротеиназой lic C перед смешиванием при 600 об/мин в термомиксере в течение одной минуты. Инкубируйте единицы во влажной камере при температуре 37 градусов Цельсия в течение 18 часов. После центрифугирования фильтрующих блоков, как это было сделано ранее, пипетку 160 микролитров буфера DB и центрифугу.

Фильтрующие блоки, через которые проходит объединенный поток, содержат пептиды, высвобождаемые эндопротеазой C. Далее собирают пептиды триптихов, как описано в текстовом протоколе. Измерение содержания пептидов в белковых расщеплениях можно проводить в разбавленном буфере, так как остатки триптофана хорошо доступны растворителю. Для количественного определения пептидов сначала пипеткой вводят 0,2 мл буфера для анализа DB в кварц Q vet.

Затем поместите Q vet в держатель qve прибора и запишите спектр излучения для бланка. Подготовьте калибровочную кривую с шагом 0,1 микрограмма, добавив один микролитр аликвоты стандартного раствора триптофана в Q vet и аккуратно перемешав с буфером db. После очистки ветеринарного теста Q введите образец пипеткой и запишите спектр образца.

Перед фракционированием приступайте к расчету концентрации белка и пептида, как описано в текстовом протоколе. Подготовьте колонку наконечника SAX, уложив шесть слоев EM. Импортируйте ионную мембрану в обычный наконечник для пипетки объемом 0,2 миллилитров. Сделайте два столбца SAX tip для каждого образца.

Далее подготовьте кончик этапа, сложив три слоя М четыре С 18. В наконечнике для пипетки объемом 0,2 миллилитра сделайте шесть ступенчатых наконечников для каждого образца. Для начала.

При фракционировании пептидные растворы, полученные в результате разложения с ly C, разбавляют 0,2 мл BRI и универсального буфера Robinson. pH 11 аналогичным образом разбавляют пептидные растворы, полученные при расщеплении с трипсином, с 0,2 мл буфера Britain и Robinson Universal. pH 5 собирают колонку наконечника SAX в крышке адаптера центробежной трубки перед промывкой и уравновешивают колонку наконечника SAX и ступенчатые наконечники C 18, как указано в текстовом протоколе.

Затем соберите колонку наконечника SAX в наконечнике ступени C 18. Загрузите образцы растворов в концевые колонки Equilibrated SAX и центрифугируйте колонки при давлении 5 000 G в течение трех минут. Промойте колонки наконечника пипетки 0,1 миллилитром разведенных образцов.

Улучшите поток путем центрифугирования при давлении 5 000 G. Перенесите колонку с наконечником SAX к следующему наконечнику стадии C 18 и продолжайте элюирование пептидов, как описано в текстовом протоколе. После промывки С 18 ступенчатыми наконечниками с 0,05 миллилитров буфера А элюируют фракции с 0,05 миллилитров буфера В во флаконы, в дальнейшем используемые для введения образцов в жидкостную хроматографическую систему, собранную с масс-спектрометром репрезентатора. Здесь приведены результаты экстракции и переваривания белка.

Лизис 250 нанолитров ткани, что соответствует микрорассеченной площади 25 квадратных миллиметров от 10-микрометрового среза, приводит к получению примерно 45 микрограммов общего белка после двухступенчатого последовательного расщепления в быстром формате с эндопротеазой срезом C и трипсином, что приводит к получению более 50% от общего количества белка. Здесь показано репрезентативное флуоресцентное измерение содержания пептидов, спектры стандарта тритофана и образец показывают максимумы на уровне от 350 до 360 нанометров. Интенсивность флуоресценции пропорциональна содержанию тритофана.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как подготовить образцы из высокой ткани к протеомному анализу с использованием техники микродиссекции, обработки образцов и фракционирования пептидов После освоения этой техники ее можно сделать за три-четыре часа плюс время, необходимое для несварения белка. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать использовать свежеподготовленные срезы ткани после ее разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области протеомики к изучению протеомов тканей и клеток, а также аномалий у человека с использованием арвала для фиксированного и паренного встроенного материала.