Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

Общая цель данной процедуры заключается в выделении гепатоцитов человека с использованием двухэтапного метода перфузии коллагеназой. Сначала в кровеносные сосуды фрагмента печени вводится ирригационная канюля. Затем следует перфузия и переваривание фрагмента печени с помощью коллагеназы.

Третьим этапом является удаление капсулы Глисона, что приводит к высвобождению диссоциированных клеток печени. Заключительным этапом является низкоскоростное центрифугирование для выделения гепатоцитов. В конечном итоге гепатоциты можно идентифицировать с помощью фазово-контрастной микроскопии или путем окрашивания на альбумин методом иммуноцитохимии, при этом жизнеспособность и выход гепатоцитов определяются с помощью теста с исключением трипан синего.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы канюляции и дигестии трудно освоить. Это связано с тем, что канюляция требует определенного мастерства, а завершение дигестии бывает трудно определить. Процедуру для лиц, впервые знакомящихся с данной техникой, продемонстрирует Натали Лун, техник из моей лаборатории.

В данной демонстрации вместо фрагмента человеческой печени мы будем использовать фрагмент печени ягненка. Подготовьте оборудование для перфузии фрагмента печени следующим образом: установите температуру водяной бани так, чтобы растворы при попадании на фрагмент печени имели температуру 37 °C. Для растворов один, два и три оптимальной будет температура 41 °C, однако для рубашки стеклянного конденсатора раствор четыре должен иметь температуру 37 °C, чтобы снизить потерю активности коллагеназы. Незадолго до начала перфузии включите газовый регулятор. Получите от патологоанатома фрагмент печени, который в идеале должен иметь преимущественно или полностью сохранную капсулу (Glisson's capsule) и только одну поверхность разреза.

Поместив фрагмент печени на воронку Бюхнера с перфорированным фильтрующим диском, необходимо заполнить перфузионную систему раствором один, используя низкую скорость потока; введите изогнутую ирригационную канюлю с оливковыми наконечниками в более крупные кровеносные сосуды на срезе фрагмента печени. По мере вымывания крови из печени ткань становится светлее в областях с хорошей перфузией. Количество используемых канюль зависит от размера печени.

Как правило, для печени массой от менее 20 г до более 80 г следует использовать от четырех до восьми канюль. Подбирайте диаметр канюли таким образом, чтобы она плотно и надежно фиксировалась. Оставьте мелкие кровеносные сосуды открытыми для оттока буфера из ткани.

Теперь увеличьте скорость потока на перистальтическом насосе до значения от 110 до 460 milliliters per minute. Перфузия считается эффективной, если фрагмент печени приобретает более светлый оттенок при используемой скорости потока. Выбор скорости зависит от размера печени: для более крупных органов используются более высокие показатели перфузии.

Как правило, средняя скорость перфузии 44 мл/мин на одну канюлю является оптимальной для печени различной массы. Выбранная скорость потока должна привести к легкому набуханию фрагмента печени. В процессе перфузии поддерживайте фрагмент печени во влажном состоянии, накрыв его кусочком марли, смоченным в физиологическом растворе.

После перфузии ткани одним литром раствора один для вымывания остатков крови из фрагмента печени, замените перфузионную жидкость на раствор два и проводите перфузию в течение 10 минут. Затем замените перфузионную жидкость на раствор три и проведите перфузию полулитром данного раствора.

Теперь замените перфузионную жидкость на раствор четыре, содержащий коллагеназу. Проводите перфузию в режиме рециркуляции в течение 9–12 минут или до достаточного переваривания печени. Ткань печени под капсулой Глиссона должна начать слегка распадаться.

При зондировании тупым концом скальпеля печень также должна ощущаться размягченной. Важно соблюдать правильное время переваривания фрагмента печени, так как избыточное переваривание может привести к низкой жизнеспособности гепатоцитов, а недостаточное — к низкому выходу гепатоцитов. Начните с выключения перистальтического насоса и извлечения канюли из фрагмента печени.

Затем поместите ткань в кристаллизационную чашку, содержащую от 100 до 200 миллилитров раствора. Пять. Осторожно извлеките капсулу и аккуратно вытряхните клетки. Если присутствуют области с плохой перфузией, можно использовать скальпель, чтобы разрезать эти участки и высвободить находящиеся в них клетки.

При необходимости добавляйте раствор пять в процессе работы, чтобы в итоге довести объем раствора пять до 500 milliliters. Теперь дважды отфильтруйте клеточную суспензию. Сначала профильтруйте клетки через нейлоновый фильтр с размером пор 210 micron в конический флакон объемом один литр.

Затем профильтруйте клетки через нейлоновый сетчатый фильтр с размером пор 70 micron в коническую колбу объемом один литр. Разлейте два равных объема клеточной суспензии в центрифужные пробирки объемом 200 milliliter. После этого центрифугируйте профильтрованную клеточную суспензию при 72 Gs в течение пяти минут при температуре четыре degrees Celsius.

Отоберите супернатант и осторожно ресуспендируйте клеточный осадок примерно в 200 миллилитрах раствора. Пять. Повторите центрифугирование и ресуспендирование трижды; после финального центрифугирования ресуспендируйте клетки в холодном растворе для хранения до конечной концентрации от 2 до 5 миллионов гепатоцитов на миллилитр. Для точного подсчета клеток с помощью гемоцитометра можно использовать анализ с трипан синим.

Здесь представлены окрашенные трипановым синим гепатоциты из 648 изоляций. Средняя жизнеспособность изолированных гепатоцитов человека составила 77 ± 10%. Средний выход гепатоцитов составил 13 ± 11 млн гепатоцитов на грамм печени. Для определения чистоты гепатоцитов использовали иммунофлуоресценцию; изолированные гепатоциты, окрашенные в зеленый цвет положительно на альбумин, имели чистоту 94 ± 1%.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили четыре раза с пятью повторностями в каждой серии. Фазово-контрастная микроскопия демонстрирует морфологические характеристики гепатоцитов, такие как большой размер клеток и полигональная форма. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать гепатоциты человека с помощью двухэтапной процедуры перфузии коллагеназой.