Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Общая цель данной процедуры заключается в применении кратковременной интермиттирующей гипоксии к микромасштабным островкам поджелудочной железы для исследования эффектов прекондиционирования. Это достигается путем первоначального изготовления мультимодального микрофлюидного устройства с тонкой газопроницаемой мембраной. Вторым этапом является создание компьютеризированной системы модуляции кислорода.

Затем глазные вставки осторожно помещают в устройство, после чего подключают микрофлюидные каналы для подачи жидкости и кислорода. Заключительным этапом является синхронизация микроскопии с мультимодальной микрофлюидикой для визуализации параметров глазной вставки, изменяющихся в процессе модуляции кислорода. В конечном итоге метод перемежающейся гипоксии глазной вставки используется для демонстрации того, что в условиях гипоксии ответ на глюкозу четко нарушен.

В то время как временная модуляция гипоксии может приучить органоиды глаза реагировать с меньшими нарушениями, основным преимуществом этой методики по сравнению с существующими методами, такими как измерение растворенного кислорода или использование гипоксической камеры, является возможность подачи точной концентрации кислорода к векам в коротких, минимальных временных интервалах без воздействия напряжения сдвига, возникающего при сложных потоках.

Оно также позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени с помощью макроскопического осмотра и микроскопии. Данный подход может помочь ответить на ключевые вопросы в области аллотрансплантации, такие как определение гипоксических нарушений в местах трансплантации или подбор режимов предобработки для улучшения результатов трансплантации. Таким образом, этот метод позволяет получить представление о гипоксии аллотрансплантата.

Этот метод также может быть применен к другим тканям и системам, таким как центральная нервная система, ткани сердца, почки и другие трансплантируемые органы. Видеодемонстрация данного метода имеет критическое значение, так как многие этапы изготовления устройства и манипуляции с лювертами сложны в освоении из-за новаторского междисциплинарного характера методики, несмотря на присущие ей сложности или привычность исполнения. Начните с изготовления верхнего слоя микрофлюидного устройства.

Для этого залейте предварительно смешанный PDMS в чистую чашку Петри до высоты 1.5 мм и полимеризуйте его при 80 °C в течение двух часов. Затем изготовьте мастер-матрицу микрофлюидного слоя для глюкозы с перфузионной камерой, нанеся методом центрифугирования два слоя SU-8 2150 толщиной 350 мкм каждый, чтобы получить единый слой толщиной 700 мкм на четырехдюймовой кремниевой пластине. После этого подвергните образец воздействию УФ-излучения с использованием фотошаблона микрофлюидного слоя для глюкозы, чтобы перенести рисунок микроканалов на слой SU-8.

Промойте необлученную область проявителем SU-8. Затем залейте предварительно смешанный PDMS DGA на MA до высоты 3 mm и отверждайте при 80 °C в течение двух часов. После отверждения вырежьте микрофлюидный слой для глюкозы по форме и используйте просекатель диаметром 2 mm для формирования входного и выходного портов, а также просекатель диаметром 8 mm для основной камеры.

Затем изготовьте мастер-форму микролунок для иммобилизации века, нанеся методом центрифугирования слой SU 8 2100 толщиной 100 micron на чистую четырехунцовую кремниевую пластину, после чего с помощью УФ-литографии перенесите рисунок микролунок на этот слой. По завершении изготовления мастер-формы микролунок удалите необлученные области с помощью проявителя. Нанесите два слоя PDMS толщиной 100 micron методом центрифугирования при 900 RPM в течение 30 секунд с последующим отверждением каждого слоя в течение 10 минут при 80 °C.

По завершении проделайте отверстия диаметром 2 мм в портах ввода и вывода. Наконец, изготовьте мастер газового микрофлюидного канала, нанеся SU 8 2100 методом центрифугирования до достижения толщины 100 мкм, как и в предыдущем слое, и повторно перенесите рисунок газового микрофлюидного канала с помощью УФ-литографии. Смойте незасвеченные области проявителем.

Затем налейте слой PDMS толщиной 1.5 millimeter на мастер газового микрофлюидного устройства и полимеризуйте при 80 °C в течение двух часов. После этого вырежьте PDMS по форме с помощью лезвия бритвы. Затем проколите входное и выходное отверстия диаметром two millimeter в покрывающем слое так, чтобы они совпадали с соответствующими отверстиями в других слоях для последующего склеивания нескольких слоев между собой.

Сначала подготовьте их, очистив поверхности с помощью клейкой ленты, подвергнув воздействию коронного разряда, а затем вручную выровняйте слои в следующем порядке. Сначала прикрепите мембрану к нижнему газовому слою микролунками вверх. Затем прикрепите глюкозный микрофлюидный слой поверх мембраны с микролунками.

Наконец, приклейте верхний слой с входным и выходным отверстиями, герметизируя всю сборку. Для обеспечения плотного соединения поместите на сборку груз массой 1 кг и подвергните воздействию температуры 100 °C в течение трех часов. Затем проверьте на герметичность.

Проверьте устройство, заполнив водный слой водой, погрузив устройство и продувая газовый слой воздухом с помощью шприца, проверяя при этом отсутствие утечек. Затем стерилизуйте герметичные устройства, пропуская 70% ethanol через водный слой в течение одной-двух минут. Подготовьте микродозаторы, сначала подключив управляющие выводы микродозаторов к прилагаемым блокам драйверов.

Затем подключите драйверы к плате цифрового ввода-вывода (IO) к портам, соответствующим элементам управления в LabVIEW. Далее подключите источники питания постоянного тока 5 В и 20 В к соответствующим контактам блоков привода и подключите плату цифрового ввода-вывода к ноутбуку для выполнения программ LabVIEW по управлению подачей газа, как описано в приложении к сопроводительному текстовому протоколу. Затем подключите один микродозатор к азоту, а другой — к сжатому воздуху (в обоих случаях с содержанием 5% carbon dioxide) и установите давление обоих газов на уровне 2 PSI. Соедините выходы дозаторов через Т-образный разветвитель перед подачей в микрофлюидное устройство.

Затем установите устройство на подогреваемую платформу инвертированного микроскопа, подключив к нему потоки кислорода с концентрацией 0% и 21%. Затем поместите волоконно-оптический датчик кислорода на выходе жидкости из устройства для измерения уровня растворенного кислорода в выходящем потоке в режиме реального времени. После этого подключите устройство к перистальтическому насосу и начните прокачивать воду через устройство со скоростью 250 µL в минуту.

Охарактеризуйте переходный отклик при модуляции содержания кислорода, циклически изменяя подачу через микродиспенсеры в диапазоне от 5 до 21% кислорода. Подключите перистальтический насос к микрофлюидному устройству и расположите трубку на нагревательном планшете с температурой 37 °C для подогрева жидкости перед ее поступлением в устройство. Также подключите выходной порт микрофлюидной системы для глюкозы к фракционному коллектору. Приступайте к препарированию мышей линии C 57 black six и выделению островков Лангерганса поджелудочной железы путем коллагеназного переваривания и разделения в градиенте плотности Ficoll, как описано в соответствующих видеороликах, доступных в JoVE, после завершения выделения.

Инкубируйте эксплантаты глаз в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина и 20 millimolar HEPES, в чашках Петри в течение 24–48 часов. Используйте эксплантаты в течение двух дней для обеспечения воспроизводимости результатов. Затем приготовьте свежий бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, как описано в сопроводительном текстовом протоколе: один раствор с концентрацией глюкозы 2 millimolar и другой — с концентрацией глюкозы 14 millimolar.

Подогрейте растворы в конических пробирках объемом 50 мл, поместив их в водяную баню при 37 °C. Затем приготовьте краситель для изолированных глазков, добавив 5 µM 4:02 AM и DMSO и 2,5 µM RH 1 23 и 100% этанол в 2 мл буфера Кребса, содержащего 2 мМ глюкозы. Далее с помощью пипетки объемом 10 µl перенесите глазки и инкубируйте их в красителе в течение 30 минут при 37 °C.

После окрашивания загрузите примерно 20 глазков в устройство через входной канал для глюкозы. Переместите глазки в камеру, прокачивая буфер из выходного отверстия обратно во входное. Затем проводите перфузию глазков и буфера в течение 10 минут для вымывания избытка красителей.

Сначала пропустите через систему 2 мМ бикарбонатный буфер Кребса-Рингера в течение пяти минут для установления нормального базового уровня пульса. Затем стимулируйте камеру буфером с 14 мМ глюкозы в течение 15 минут, после чего проведите промывку буфером с 2 мМ глюкозы в течение 15 минут. В ходе этого процесса регистрируйте эмиссию на длине волны 510 нм при возбуждении на 340 нм и 380 нм.

Также зарегистрируйте эмиссию RH 1 23 на 530 нм, возбуждая краситель при 480 нм. Чтобы свести к минимуму конвекционные возмущения во время модуляции кислорода, подавайте буферный поток на этапах стимуляции и промывки, и обязательно останавливайте поток на остальных этапах тестирования. Собирайте эффлюент из выходного отверстия для глюкозы с интервалом в одну минуту для дальнейшего анализа с использованием микрофлюидного подхода, показанного в этом видео; с помощью компьютеризированных микроинжекторов можно быстро регулировать процент кислорода, проходящего через тонкую мембрану из PDMS.

Ниже приведен пример такой модуляции продолжительностью от одной до шести минут. Также возможно обеспечить количественную субминутную модуляцию кислорода в диапазоне от 2 до 8,5 ppm путем подачи кислорода в концентрации от 5 до 21%. Синяя линия показывает процент подаваемого кислорода, а зеленая — результирующий уровень растворенного кислорода в ppm. При применении такого циклического воздействия для создания интермиттирующей гипоксии в островках можно наблюдать преимущества прекондиционирования островков к гипоксии по сравнению с нерегулярным нормоксическим импульсом, оценивая улучшение соотношения после воздействия. Эффекты гипоксии и интермиттирующей гипоксии проявляются в виде овершута и затухания осцилляций кальциевых транзиентов; здесь синим цветом показан нормоксический ответ.

Красным цветом показан гипоксический ответ, а зеленой линией — обусловленный гипоксический ответ. Здесь представлены показатели уровня кальция, митохондриального потенциала и инсулина. Они получены с помощью флуоресцентной микроскопии в реальном времени и анализа EISA вне чипа с использованием микрофлюидного эффлюента из системы; в совокупности эти данные позволяют сформировать мультимодальное представление об инсулиновом ответе на глюкозу при транзиторной гипоксии.

После освоения эта методика может быть выполнена за два дня при условии правильного соблюдения протокола: один день отводится на изготовление устройства и выделение клеток века, и один день — на проведение самих экспериментов с веком. При выполнении данной процедуры важно не забывать проверять подаваемую концентрацию кислорода, калибруя газовый анализатор устройства после его разработки. Данная методика открыла исследователям в области микрофизиологии плодного вывода и других тканей возможность изучить, как гипоксия и временные режимы подачи кислорода могут влиять на такие заболевания, как сахарный диабет, сердечно-сосудистые и неврологические расстройства.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как контролировать модуляцию кислорода, манипулировать микротканями и получать воспроизводимые, значимые показатели гипоксии тканей с помощью мультимодальных микрофлюидных устройств.