Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня

Общая цель этой процедуры заключается в применении минутной масштабной интермиттирующей гипоксии к микромасштабным глазкам поджелудочной железы для изучения эффектов предварительного кондиционирования. Для этого сначала изготавливается мультимодальное микрофлюидное устройство с тонкой газопроницаемой мембраной. Второй шаг – создание компьютеризированной системы модуляции кислорода.

Далее в аппарат аккуратно загружаются люверсы, а затем подключается жидкая и кислородная микрофлюидика. Заключительным этапом является согласование микроскопии с мультимодальной микрофлюидикой с целью визуализации параметров глазков, которые изменяются во время кислородной модуляции. В конечном счете, метод прерывистой гипоксии с помощью глазков используется для того, чтобы показать, что реакция глюкозы явно нарушена при гипоксии.

В то время как временная модуляция гипоксии может тренировать глазки реагировать с меньшими нарушениями. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как растворение кислорода или использование гипоксической камеры, заключается в том, что она точна. Концентрация кислорода может быть доставлена к векам за быстрые, крошечные промежутки времени без явного стресса от сложных потоков.

Он также позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени с помощью напольной и микроскопии. Этот мастер может помочь ответить на ключевые вопросы в области трансплантации Alli, такие как определение гипоксических нарушений в местах трансплантации или схемы предварительного кондиционирования для улучшения результатов трансплантации. Таким образом, этот метод может дать представление о гипоксии Алли.

Он также может применяться к другим тканям и системам, таким как центральная нервная система, сердечные ткани, почки и другие органы для трансплантации. Видеодемонстрация этого метода имеет решающее значение, так как многие из устройств изготавливаются и ручки с проушинами. Эти шаги трудно освоить из-за нового междисциплинарного характера техники, но они присущи сложному или знакомому Begin путем изготовления защитного слоя микрофлюидного устройства.

Для этого в пустую чашку Петри насыпают предварительно перемешанный PDMS DGAs на высоту 1,5 миллиметра и выдерживают его при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем изготовьте микрофлюидный слой глюкозы с помощью мастера камеры Profusion путем нанесения слоя на два слоя SU 8 21 50 толщиной 350 микрон с образованием одного слоя толщиной 700 микрон на четырехдюймовой силиконовой пластине. Затем подвергните его воздействию ультрафиолетового света с помощью фотомаски с микрофлюидным слоем глюкозы, чтобы перенести рисунок микроканала на слой SU eight.

Смойте неэкспонированный участок проявителем SU eight. Затем налейте предварительно смешанные PDMS DGA на MA на высоту трех миллиметров и отверждайте при 80 градусах Цельсия в течение двух часов. После отверждения разрежьте микрофлюидный слой глюкозы по форме и используйте двухмиллиметровый пуансон для формирования входного и выходного отверстий, а также восьмимиллиметровый пробойник диаметром для основной камеры.

Затем изготовьте мастер микролунок для иммобилизации век путем нанесения слоя SU 8 2100 толщиной 100 микрон на чистую четырехдюймовую силиконовую пластину, а затем с помощью УФ-литографии перенесите рисунок микролунки на этот слой. Промойте неоткрытые участки проявителем, когда мастер микролунок будет готов. Добавьте два слоя PDMS по 100 микрон путем отжима покрытия со скоростью 900 об/мин в течение 30 секунд, а затем отверждения в течение 10 минут при 80 градусах Цельсия для получения каждого слоя.

После этого пробейте входное отверстие диаметром два миллиметра в выпускных отверстиях. Наконец, изготовьте газовый микрофлюидный мастер путем вращения SU 8 2100 толщиной до 100 микрон, как в предыдущем слое, и снова перенесите газовые микрофлюидные модели с помощью УФ-литографии. Смойте необлученный участок проявителем.

Затем налейте слой PDMS толщиной 1,5 миллиметра на газовый микрофлюидный мастер и отверждайте при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем разрежьте PDMS по форме лезвием бритвы. Затем проделайте входные и выпускные отверстия диаметром два миллиметра в защитном слое, чтобы выровнять их с местами на других слоях, чтобы соединить несколько слоев вместе.

Сначала подготовьте их, очистив поверхности скотчем, обнажив на них дугу короны, а затем выровняв слои вручную в следующем порядке. Сначала приклейте мембрану к нижнему слою газа микролунками вверх. Затем свяжите микрофлюидный слой глюкозы поверх мембраны микролунки.

Наконец, соедините входной и выходной слой на самом верху, герметизируя всю сборку. Помогите сформировать прочное соединение, добавив килограммовый груз поверх сборки и запекайте ее при температуре 100 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем протекает.

Проверьте устройство, загрузив воду в водный слой, погрузив устройство в воду и пропустив воздух через газовый слой с помощью шприца, одновременно ища утечки. Наконец, простерилизуйте герметичные устройства, пропустив 70% этанол через водный слой в течение одной-двух минут. Настройте микродозаторы, предварительно подключив провода управления микродозаторами к входящим в комплект блокам привода.

Затем подключите драйверы к цифровой плате ввода-вывода через порты, соответствующие их элементам управления лабораторным видом. Затем подключите пятивольтовые и 20-вольтовые источники питания постоянного тока к соответствующим контактам на приводах и подключите цифровой ввод-вывод к ноутбуку, чтобы выполнить лабораторные коды для контроля газа, как описано в приложении к сопроводительному текстовому протоколу. Затем подключите один микродозатор к азоту, а другой к сжатому воздуху, оба содержат 5% углекислого газа, и установите оба газа на два PS. Я подключаю выходы дозатора к Т-образному соединению перед входом в микрофлюидное устройство.

Затем установите устройство на нагреваемый предметный столик инвертированного микроскопа с подключенным к устройству кислородом 0% и 21%. Затем поместите волоконно-оптический датчик кислорода на выходе жидкости устройства для измерения растворенного кислорода на выходе в режиме реального времени. Затем подключите устройство к перистальтическому насосу и начните подавать воду через устройство со скоростью 250 микролитров в минуту.

Определите характеристику переходной реакции модуляции кислорода путем циклического переключения микродозаторов в диапазоне от 5 до 21% кислорода. Подключите перистальтический насос к микрофлюидному устройству и расположите трубку над горячей плитой с температурой 37 градусов Цельсия, чтобы нагреть жидкость перед тем, как она попадет в микрофлюидное устройство. Кроме того, подключите выходной порт микрофлюидики глюкозы к коллектору фракций, чтобы начать препарирование C 57 у черных шести мышей и изолировать глазки поджелудочной железы путем расщепления коллагеназы и разделения градиента плотности F-ccal, как описано в следующих видеороликах, доступных в JoVE после выделения.

Инкубируйте глазки в среде RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% пенициллина стрептомицина и 20 миллимолярных кучах, в чашках Петри в течение 24–48 часов. Используйте люверсы в течение двух дней, чтобы обеспечить стабильные результаты. Затем приготовьте свежий бикарбонатный буфер Кребса Рингера, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, с одним раствором, содержащим два миллимоляра глюкозы, и другим, содержащим 14 миллимолярных глюкоз.

Прогрейте растворы в 50 миллилитровых конических трубках, поместив их на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Затем приготовьте краситель для изолированных глазков, добавив пять микромоляров 4:02 AM и DMSO и 2,5 микромоляра RH 1, 23 и 100% этанола к двум миллилитрам буфера Кребса, содержащего два миллимоляра глюкозы. Далее возьмите люверсы пипеткой объемом 10 микролитров и выдержите их в морилке в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После окрашивания загрузите примерно 20 люверсов в устройство через входное отверстие для микроканала глюкозы. Направьте проушины в камеру, заправив буфер из выпускного отверстия обратно во входное отверстие. Затем перфузируйте люверсы и буфер на 10 минут, чтобы смыть излишки красителей.

Сначала проведите через систему двухмиллимолярный бикарбонатный буфер Кребса в течение пяти минут, чтобы установить нормальную базу импульсов. Затем стимулируйте камеру 14-миллимолярным буфером глюкозы в течение 15 минут, после чего 15-минутное промывание двухмиллимолярным буфером глюкозы. Во время этого процесса запишите 510 нм для двух излучений, возбуждая диету на 340 нм и 380 нм.

Кроме того, зарегистрируйте эмиссию 530 RH 1 23 путем возбуждения красителя на 480 нанометрах. Чтобы свести к минимуму конвективные возмущения во время модуляции кислорода, применяйте буферный поток на этапах стимуляции и промывки и обязательно останавливайте поток на других этапах во время тестирования. Собирайте выделения из выходного отверстия глюкозы с интервалом в одну минуту для использования в дополнительном анализе с использованием микрофлюидного подхода, показанного в этом видео, можно быстро регулировать процент кислорода, проходящего через тонкую мембрану PDMS, с помощью компьютеризированных микроинжекторов.

Вот пример такой модуляции в диапазоне от одной минуты до шести минут. Также можно обеспечить количественную субминутную модуляцию кислорода в диапазоне от двух до 8,5 частей на миллион, подавая кислород в диапазоне от пяти до 21%. Синяя линия показывает процент доставляемого кислорода, а зеленая — результирующий растворенный кислород в частях на миллион. Когда этот цикл применяется для создания прерывистой гипоксии в проушинах, можно наблюдать преимущества предварительного кондиционирования глазков против гипоксии по сравнению с нерегулярным нормоксическим пульсом, наблюдая за улучшенным соотношением эффектов гипоксии и интермиттирующей гипоксии, которые могут наблюдаться в превышении и затухании колебаний кальциевых переходных процессов, как показано здесь синим цветом, является нормоксической реакцией.

Красным цветом обозначена гипоксическая реакция, а зеленой — условная гипоксическая реакция. Здесь показана мера кальция, митохондриального потенциала и инсулина. Они являются результатами флуоресцентной микроскопии в реальном времени и анализа EISA с использованием микрофлюидных выделений из системы вместе, они начинают строить мультимодальное представление о реакции глюкозы на инсулин при гипоксическом переходном процессе.

После того, как эта техника будет освоена, она может быть завершена за два дня, если она выполнена правильно: один день для изготовления устройства и выделения клеток век и один день для экспериментов с самими веками. При попытке выполнить эту процедуру важно не забыть проверить концентрацию подаваемого кислорода, соединив газогенератор устройства после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области выходного отверстия плода и других тканевых микрофизиологий, чтобы изучить, как гипоксия и временные кислородные режимы могут влиять на такие заболевания, как диабет, сердечно-сосудистые и неврологические расстройства.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как управлять модуляцией кислорода, манипулировать микротканями и проводить воспроизводимые, значимые измерения гипоксии тканей с помощью мультимодальных микрофлюидных устройств.