Оптимизированные протоколы для

Цель данной работы — продемонстрировать способ приготовления суспензии липидов микобактерий с высокой жизнеспособностью для введения мышам линии nude. Мы будем выделять исходный материал из инфицированной мыши, предпочтительно на ранней стадии инфекции.

Для обеспечения высокого выхода жизнеспособных артерий проведите эвтаназию животного внутри шкафа биологической безопасности. Зажмите задний пульс гемостатическим зажимом. Отсеките их вместе с захватами и погрузите в 2% раствор йода на 20 минут. Для деконтаминации зафиксируйте точку, расположив подушечку лапы вверх.

Сбор мягких тканей. С помощью скальпеля удалите кости первой и пятой фаланг, чтобы облегчить гомогенизацию ткани. Поместите ткань в стерильную чашку Петри. Соскоблите эпидермис.

Разрежьте гранулематозную ткань ножницами на мелкие кусочки и отложите их для последующего расчета выхода ткани. Перенесите мелкие кусочки в пробирку, содержащую 1 ml сбалансированного солевого раствора Хэнкса. Добавьте еще 1 ml раствора Хэнкса и гомогенизируйте ткань трижды по 15 секунд на скорости Four.

Поместите клеточный фильтр в стерильную коническую пробирку объемом 50 ml. Перенесите суспензию пипеткой на фильтр и дайте раствору пройти через него под действием силы тяжести. Для удаления клеточного дебриса добавьте в суспензию еще два MLS раствора Хэнкса и повторно гомогенизируйте ее.

Используя тот же цикл, пропустите суспензию через это сито. Промойте сито, добавив раствор Хэнкса. Чтобы довести общий объем суспензии до 9 мл, добавьте в суспензию 1 мл 0,5% раствора трипсина до конечной концентрации около 0,05%.

Перемешайте содержимое, осторожно переворачивая пробирку, и инкубируйте при 37 °C в течение 60 минут. После инкубации доведите объем суспензии до 4 mL, добавив стерильный физиологический раствор; центрифугируйте при 1700 ×g в течение 30 минут при 4 °C, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок, постукивая по пробирке. Добавьте 1 mL стерильного физиологического раствора и перемешайте.

Перенесите суспензию в новую пробирку. Гомогенизируйте сосудистую суспензию, используя инсулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 26G, в процессе переноса суспензии в новую пробирку. Проведите микробиологический контроль суспензии, нанеся две капли на среду 18 и семь капель на среду BHI (инфузат мозга и сердца).

11 Stein Genesen инкубировали при 37 °C. Затем следовало провести стандартные процедуры микробиологического контроля. Для окрашивания по методу Z.

Приготовьте разведения суспензии S в физиологическом растворе в соотношениях 1:10 и 1:100. Гомогенизируйте каждое разведение перед подготовкой предметных стекол для подсчета; подготовьте три стекла, нанеся на поверхность каждого по три круга внутренним диаметром 10 мм с помощью перманентного маркера.

Теперь обведите круги маркером для иммуногистохимии. Пронумеруйте эти предметные стекла карандашом твердости №2, подготавливая их для трех концентраций сыворотки: неразбавленной, 1:10 и 1:100.

Пипетируйте 5 µL раствора сыворотки с фенолом и 10 µL суспензии сари в каждый круг, гомогенизируйте и равномерно распределите суспензию по всей площади круга. С помощью ручки одноразовой петли поместите эти стекла на ровный стол для высушивания. После высушивания зафиксируйте их, трижды проведя каждое стекло через синее пламя горелки, держа стекла суспензиями вверх.

Выполните поддержание культуры Zuni (code Zuni). Изучите данные предметные стекла. Три разведения.

Выберите наиболее подходящее разведение для подсчета sary. Приготовьте 200 µL суспензии погибших sary, автоклавировав сосудистую суспензию в течение 30 минут при 121 °C. Для флуоресцентного окрашивания липидов микробактерий используйте набор для определения жизнеспособности бактерий L 7 0 0 7 live dead back light.

Приготовьте разведение раствора A 1:10 и разведение раствора B 1:20 непосредственно перед использованием. К каждыми 200 µL исходной и инактивированной неразбавленной суспензии сосудов добавьте 3,6 µL разведенного раствора A и 6 µL разведенного раствора B. После 15 минут инкубации в темноте центрифугируйте суспензию при 10 600 ×g в течение пяти минут при температуре 4 °C. Удалите супернатант с помощью пипетки.

Ресуспендируйте осадок в 50 µL 10% глицерина, гомогенизируя его путем многократного пипетирования. Нанесите восемь µL каждой суспензии на предметное стекло и накройте небольшим покровным стеклом. Храните в защищенном от света месте.

Рассматривают суспензии под флуоресцентным микроскопом. Готовят суспензию с концентрацией от 10 до семи BA lip на мл, наливая по 1 мл среды для замораживания в каждую криопробирку. Затем добавляют 150 µL суспензии S к 1 мл среды для замораживания и гомогенизируют смесь, переворачивая пробирку.

Поместите криопробирку в контейнер для замораживания. Выдержите контейнер при температуре -80 °C в течение не менее 24 часов. Перенесите пробирки в бокс для хранения и храните их при температуре -80 °C до момента размораживания.

Разморозьте замороженную суспензию на водяной бане при температуре 37 °C. Перенесите суспензию в коническую пробирку, содержащую 20 мл стерильного физиологического раствора. Центрифугируйте для концентрирования.

Для подсчета использовали протокол поддержания Z, а для определения жизнеспособности — протокол флуоресцентного окрашивания. Готовили суспензию, содержащую от 10 до 8 BA на порцию; перед инокуляцией каждого животного суспензию гомогенизировали. В инсулиновый шприц набирали 100 µL и вводили по 30 µL в пяточные подушечки задних лап каждого животного при определении жизнеспособности.

Зеленая флуоресценция наблюдается во всех BAI, а красная — только в bai. Когда BAI являются чистым контролем, наблюдается одинаковая интенсивность зеленого и красного свечения BAI. Инокуляция M Lepar, замороженного на разные периоды, приводит к увеличению количества восстановленных BAI в 10–1000 раз через семь месяцев.

В заключение мы хотели бы добавить, что, поскольку IL leid не растет in vitro, данный протокол обеспечивает быстрый и простой способ поддержания жизнеспособности yl Leid для дальнейшего использования в лаборатории.