Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в получении серии снимков (таймлапс-визуализации) поведения глиальных клеток после повреждения периферического нерва у живых личинок данио-рерио. Для этого сначала анестезированные личинки zebrafish монтируют в низкоплавящийся агар в чашки Петри со стеклянным дном и позиционируют с помощью препаровальной иглы. Затем смонтированные личинки помещают на конфокальный микроскоп.

Выбирается нерв для абляции и выполняется получение изображения аксонов и глиальных клеток неповрежденного нерва. Затем вдоль нерва выбираются области интереса (ROI) и производится лазерное облучение для абляции выбранных участков, что приводит к трансекции нерва. В завершение осуществляется таймлапс-визуализация аксонов и глиальных клеток после трансекции нерва.

В конечном итоге, с помощью конфокальной микроскопии в режиме таймлапс можно получить результаты, демонстрирующие динамику поведения глиальных клеток в процессе дегенерации и регенерации нерва. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области регенерации и биологии глиальных клеток, такие как: как глиальные клетки реагируют на повреждение нерва? И каким образом различные подтипы глии координируют свое поведение в процессе дегенерации и регенерации?

После скрещивания взрослых особей zebrafish, несущих трансгены для флуоресцентного маркирования интересующих типов мотонейронов и глиальных клеток, и инкубации эмбрионов до 24 часов после оплодотворения (HPF), удалите воду из яиц и замените ее раствором 1 pH PTU в воде для яиц, после чего верните эмбрионы в инкубатор. С этого момента и примерно до 96 HPF используйте флуоресцентный диссекционный микроскоп для скрининга эмбрионов на наличие желаемого флуоресцентного гена. Перенесите положительные эмбрионы в свежий раствор PTU в воде для яиц и верните их в инкубатор.

Когда личинки достигли шести дней после оплодотворения (DPF), выберите несколько эмбрионов для монтажа и перенесите их в чашку меньшего размера. Удалите воду из чашки и немедленно замените ее на 0,02% tricaine в воде для яиц с PTU; выдержите личинок в анестетике примерно пять минут. Поместите каплю 0,8% низкоплавящего агарозы, предварительно приготовленной согласно текстовому протоколу, в стакан с водопроводной водой и поместите в микроволновую печь.

В течение 30 секунд или до полного расплавления агарозы давайте стакану остыть, пока пробирка с агарозой не станет теплой на ощупь. Затем перенесите анестезированную личинку в стеклянную чашку с плоским дном диаметром 35 мм. Удалите всю воду из чашки.

Затем немедленно залейте личинок достаточным количеством теплого агароза, чтобы заполнить часть чашки со стеклянным дном. По мере затвердевания агароза с помощью dissecting needle расположите личинку на боку. Затем слегка наклоните ее на спину, убедившись, что зафиксированная личинка касается стекла на дне чашки, что необходимо для нанесения повреждений и визуализации.

Используйте иглу, чтобы удерживать личинку в нужном положении до затвердевания агарозы и иммобилизации личинки. Затем медленно пипетируйте в чашку достаточное количество воды с триказолом, чтобы полностью покрыть агарозу и личинку. Включите все оборудование конфокального микроскопа, соответствующие диодные лазеры для возбуждения трансгенов zebrafish и азотно-накачиваемый красильный лазер.

Убедитесь, что установлен пустой светоделитель, а также кювета с красителем и coer на 435 нанометров. Полностью откройте аттенюатор лазера, затем запустите программное обеспечение для визуализации, используя объектив с погружением в воду 63 x 1.2 na и предметное стекло с одной зеркальной стороной. Используя освещение в светлом поле, найдите и сфокусируйтесь на царапине или насечке на зеркале.

Используя программное обеспечение для визуализации, найдите и сфокусируйте область травления на экране компьютера в окне управления калибровкой лазера и настройками мощности. На главной панели инструментов установите количество импульсов равным одному, а коэффициент ослабления — 3%transmission. Выберите инструмент «Эллипс» и щелкните по изображению на экране компьютера.

Чтобы создать одну круглую область интереса (ROI), повторите этот процесс еще три раза, пока на изображении не появится четыре круглых ROI, расположенных случайным образом. Затем произведите лазерное облучение. Если лазер работает и откалиброван правильно, в каждой из четырех круглых ROI возникнут небольшие точечные вытравливания. После этого снимите предметное стекло со столика микроскопа и очистите объектив.

Замените пустой светоделитель на светоделитель с пропусканием 100%ILL для пересечения двигательного нерва с помощью лазерной абляции. Нанесите небольшую каплю иммерсионной жидкости на объектив и установите чашку с закрепленной личинкой на соответствующий предметный столик, используя зажимы для стабилизации, ориентируясь по окуляру и широкопольному освещению. Сфокусируйтесь на личинках и найдите двигательные нейроны.

Просканируйте нервы в гемисегментах с 10 по 20 и выберите двигательный нерв для перерезки. Затем выведите изображение нерва в режиме реального времени на экран компьютера. Выберите Z-плоскости и получите изображение аксонов и глиальных клеток неповрежденного нерва.

Затем настройте параметры таймлапс-визуализации для получения Z-проекций всех типов клеток с интервалом от 5 до 30 минут. В зависимости от условий эксперимента извлеките светоделитель 100%ILL и замените его заглушкой. Вернитесь к режиму просмотра нерва в реальном времени и используйте соответствующий флуоресцентный канал, чтобы визуализировать аксоны, которые будут пересечены.

С помощью инструмента «Эллипс» создайте узкую эллиптическую область интереса (ROI) в зоне, подлежащей абляции. Затем создайте более мелкие ROI внутри выбранной области в окне управления настройками лазера. Установите количество импульсов на два, а коэффициент пропускания аттенюатора — на 18%transmission.

Затем произведите лазерное облучение в выбранных областях интереса (ROI). Подождите 10 или более секунд и снова проверьте область абляции на наличие флуоресценции. Учитывайте, что ROI может изначально казаться аблированной, когда на самом деле произошло фотообесцвечивание, и в процессе абляции может потребоваться небольшая корректировка ROI для достижения полного пересечения.

Если флуоресценция возвращается, увеличьте мощность лазера и произведите облучение. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока флуоресценция в области R OIS не исчезнет и не будет возвращаться в течение 10 секунд. После завершения абляции начните таймлапс-съемку, и дождитесь ее окончания.

Используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы скомпилировать данные и создать цветные композитные Z-проекции для каждой временной точки. Создайте видеоролик в формате QuickTime для одновременного анализа поведения аксонов и глиальных клеток. Описанный здесь метод может быть использован для оценки реакции глиальных клеток и других популяций клеток, связанных с нервами, на повреждение аксонов in vivo.

Здесь представлен пример повреждения нерва, созданного с помощью данного метода, и реакция окружающих глиальных клеток. Эксперимент проводился на трансгенных рыбах-зебра на 6-й день после оплодотворения (DPF), экспрессирующих мембранно-таргетированный EGFP в перинейральной глии и цитозольный DS red в мотонейронах. Повреждение было нанесено вдоль ростральной проекции моторного нерва туловища, после чего была выполнена таймлапс-визуализация в каналах EGFP и DS red.

Это позволило одновременно визуализировать поведение аксонов и глиальных клеток сразу после повреждения. Данные изображения представляют собой статические кадры, взятые из видеозаписи с интервальной съемкой. Пунктирный эллипс обозначает область интереса (ROI), которая была подвергнута абляции с помощью лазера на первой минуте.

После перерезки или через время MPT область абляции была лишена флуоресценции, а зона повреждения составляла примерно 3.5 micrometers от проксимального до дистального конца. Успешность перерезки можно подтвердить, визуализируя дистальный конец нерва и выявляя признаки валлеровской дегенерации, включая фрагментацию дистальных аксонов и их быструю элиминацию. Отсутствие флуоресценции аксонов вдоль дистального конца через 120 MPT указывает на то, что эти аксоны действительно подверглись валлеровской дегенерации и перерезка прошла успешно.

Настройка мощности лазера на оптимальный уровень имеет решающее значение при проведении экспериментов по лазерной абляции. Оптимальные настройки мощности лазера обеспечивают чистую абляцию нерва строго в пределах выбранной области интереса (ROI); при этом слишком низкая или слишком высокая мощность приведет к субоптимальным результатам. На данном примере показано повреждение, выполненное при слишком низкой мощности лазера. После срабатывания лазера флуоресценция сохранилась внутри ROI, что привело к неполному пересечению.

С другой стороны, как показано на этом рисунке, слишком высокая мощность лазера приводила к чрезмерно обширной абляции. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как фиксировать личинок zebrafish для экспериментов по лазерному пересечению. Выполните пересечение с помощью азотно-накачиваемого красительного лазера и оцените реакцию окружающих клеток с помощью конфокальной imaging в режиме тайм-лапс.