Автоматизированная Высокая пропускная Поведенческий анализ в личинки данио

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении поведенческих дефектов у личинок данио-рерио после обработки токсикантами или фармацевтическими препаратами. Это достигается путем предварительного сбора и обработки эмбрионов или личинок химическими веществами до первых семи дней развития. Второй шаг – изготовление агродорожек для плавания с использованием специально разработанных форм.

Далее обработанные личинки помещаются в дорожки агроса для поведенческого анализа с помощью покадровой фотосъемки. Последним шагом является импорт изображений в изображение J и использование специального макроса, написанного внутри компании, для сбора данных о координатах XY личинок на дорожках. В конечном счете, высокопроизводительный поведенческий анализ используется для выявления различий в избегании и поведении по оси фигма, а также в скорости плавания и отдыха между группами лечения.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, подобными коммерчески доступным, заключается в том, что мы можем использовать наш метод для наблюдения за более сложным поведением. Он также недорог в сборке и прост в настройке. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейробиологии, например, как токсиканты влияют на развитие мозга и поведение во время раннего воздействия эмбриона.

Это также может дать представление о тонких дефектах мозга у людей, которые не могут быть обнаружены с помощью других современных тестов на токсичность. Как правило, особи, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что поймать личинок может быть сложно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы имеют кривую обучения, поскольку протокол включает в себя специально созданные системы.

Для начала этой процедуры вставьте в емкости стеклянную посуду Pyrex с искусственной травой, изготовленной из зеленой пряжи. На рассвете оставьте посуду в емкостях на два часа для того, чтобы собрать эмбрионы рыбок данио. Залейте стеклянные чашки с эмбрионами над ручным ситечком с деионизированной водой.

Затем вырастите эмбрионы в яичной воде, содержащей 60 миллиграммов на литр растворимого океана в деионизированной воде и 0,25 миллиграмма на литр метиленового синего, который используется в качестве ингибитора плесени. Эмбрионы могут быть размещены в количестве от 50 до 60 личинок на 50 миллилитров или в больших резервуарах для разведения до тех пор, пока эмбрионы не будут готовы к обработке токсикантами. В зависимости от гипотезы конкретного эксперимента, эмбрионы могут быть обработаны немедленно или на определенных стадиях развития с использованием токсикантов или фармацевтических препаратов, которые обычно растворяют в ДМСО, а затем дополнительно разбавляют непосредственно в водной среде для яиц.

Синий цвет используется для видеодемонстрации во время лечения эмбрионов и личинок. Личинки и эмбрионы могут быть размещены в глубоких чашках Петри с плотностью от 50 до 60 личинок на 50 миллилитров до тех пор, пока поведенческий анализ через семь дней после оплодотворения не будет менять водный раствор для яиц, по крайней мере, через день, чтобы избежать роста грибков или бактерий из мертвых эмбрионов. Пластиковые формы были изготовлены для создания дорожек с помощью aros, которые заливаются в пластиковые пластины с одной лункой от Thermos Scientific.

Формы содержат пять полос, в которых стороны расположены под углом 60 градусов. Размеры пресс-форм и пластин см. в текстовом протоколе, сопровождающем это видео? Во-первых, приготовьте арос, растопив 0,8% арос в деионизированной воде с 60 миллиграммами на литр растворимого океана.

Затем сгенерируйте дорожки, вылив 50 миллилитров расплавленного ароса в одну луночную пластину. Затем очень медленно поместите форму поверх жидкости, которая устраняет образование пузырей. Снимите форму, когда арос остынет.

Дорожки aros можно хранить при комнатной температуре с крышками на посуде до 36 часов. Для высокопроизводительного поведенческого анализа шкафы обработки изображений подготавливаются с 15-мегапиксельной цифровой камерой, прикрепленной к верхней части шкафа и обращенной вниз в нижней части корпуса. Ноутбук с экраном 15,6 дюймов размещается экраном вверх.

Для того чтобы избежать перегрева личинок, лучше всего использовать ноутбук с температурой экрана, которая не поднимается выше 28 градусов по Цельсию. Сверху на экран ноутбука поместите пластиковый диффузор, на котором будут размещены тарелки агроса. Рассеиватель предотвратит появление большего количества узоров на собранных изображениях.

Чтобы начать съемку, осторожно переместите личинок из чашки Петри в агрос, чтобы уменьшить стресс личинок. До 20 личинок могут быть размещены на каждой дорожке, но пять личинок на дорожку обычно используются для обеспечения наиболее точного отслеживания скорости плавания и для уменьшения количества личинок, необходимых для эксперимента, заполняют дорожки яичной водой, с фармацевтическими препаратами или токсикантами или без них, в зависимости от эксперимента. Не заполняйте дорожки до тех пор, пока они не будут помещены в шкафы для визуализации, чтобы предотвратить переполнение.

Подождите 10 минут, чтобы личинки акклиматизировались после периода акклиматизации. Расположите четыре пластины вручную прямо над экраном ноутбука. В это время дорожки могут быть покрыты яйцом, водой или химической обработкой, чтобы они были на одном уровне с верхней частью дорожки, чтобы устранить тени по краям дорожек.

В изображениях компьютер программируется для покадровой съемки, делая снимки каждые шесть секунд, что в общей сложности составляет 300 изображений за эксперимент. Установите камеру на более низкое разрешение для получения изображений со скоростью видео. В то время как более низкое разрешение ограничивает записи одной многолуночной пластиной.

Видеозаписи подходят для съемки соревнований по быстрому плаванию. Используйте презентацию PowerPoint в качестве отталкивающего стимула для личинок в этой демонстрации. PowerPoint начинается с пустого белого фона в течение 15 минут, за которым следует 15 движущихся красных полос в верхней половине тарелки.

Чтобы избежать испарения жидкости в пределах дорожки aros, максимальное время визуализации не должно превышать одного часа. Откройте изображения с изображением J в этой демонстрации. Используется собственный макрос для анализа личинок по пяти полосам, который может быть доступен любому пользователю.

Используйте подсказки в макросе для установки параметров, таких как количество изображений и цвет для вычитания. Затем макрос автоматически разделяет цветовой канал, чтобы можно было удалить красный цвет. Вычитает фон, применяет пороговое значение и идентифицирует личинки с помощью анализа частиц.

После того, как все изображения будут пропущены через изображение J Macro, будет отображен файл результатов, содержащий координаты XY отдельных личинок для каждого изображения, а также номер изображения и номер полосы. Сохраните файл результатов в формате Excel и отсортируйте его по пустому фону и фону движущейся полосы, а затем по номеру ячейки. Используйте шаблон Excel со встроенными уравнениями для автоматического определения размещения личинок в лунках, расстояния между личинками, скорости передвижения и количества отдыха.

Самый последний шаблон Excel, созданный в лаборатории Cretin, доступен по запросу в виде графиков, показывающих различные группы лечения на листе Excel, вместе с Т-критерием для сравнения групп лечения и контрольной группы. Дальнейший статистический анализ может быть выполнен с помощью программы статистики SPSS. Результаты получены для личинок, обработанных яичной водой и ДМСО в качестве контроля, и различных концентраций фосфорорганического пестицида, обычно встречающегося в неорганических продуктах питания.

Здесь белые столбцы показывают данные от личинок, подвергшихся воздействию пустого фона, а красные столбцы показывают данные от личинок, подвергшихся воздействию красной движущейся полосы. Контроль. Личинки, выращенные в яичной воде, проявляют повышенное предпочтение находиться внизу в блюде после того, как им показывают движущуюся красную полосу. Аналогичные результаты получаются при выращивании личинок в яичной воде, содержащей один микрограмм на миллилитр ДМСО, растворителя, который обычно используется для растворения различных фармацевтических препаратов и токсикантов в виде 1000 стандартных растворов.

На графиках указаны измерения, которые могут быть получены с помощью поведенческого анализа, включая процент личинок внизу полосы, процент личинок в конце полосы, процент личинок на краю дорожки, расстояние между рыбами, скорость плавания личинок и процент времени, в течение которого личинки находятся в состоянии покоя. Показанные результаты представляют собой выборку из одного эксперимента. Тем не менее, при повторении результаты показывают, что скорость плавания и поведение фигмы изменяются из-за низких концентраций фосфорорганических пестицидов, которые имитируют уровни в пище человека.

Наиболее важным аспектом этой процедуры является необходимость поддерживать культуральную среду в чистоте, ежедневно заменяя ее на новую.