Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Общая цель следующего эксперимента заключается в выделении липополисахарида с внешней поверхности грамотрицательных бактерий и структурной характеристике его липидной части с использованием протоколов тандемной масс-спектрометрии (MS). Это достигается путем химической экстракции липополисахарида с поверхности бактериальной клетки с последующим мягким кислотным гидролизом для высвобождения липида A из полисахаридной части липополисахарида. На втором этапе раствор липида A анализируют с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS/MS).

В нашей процедуре для структурной характеристики липида А используется анализ методом масс-спектрометрии с тандемным разделением (МС/МС) с применением либо коллизионной диссоциации, либо ультрафиолетовой фотодиссоциации. Результаты демонстрируют различия в характере фрагментации масс-спектров, полученных с помощью протоколов МС/МС на основе коллизионной диссоциации или ультрафиолетовой фотодиссоциации, при этом UVPD обеспечивает более информативный паттерн фрагментации. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами является то, что тандемная масс-спектрометрия позволяет идентифицировать целевые аналиты на основе интерпретации диагностических паттернов фрагментации.

Фотодиссоциация под действием ультрафиолетового излучения, в частности, представляет собой метод МС/МС с высокой энергией, который позволяет получать более разнообразные фрагментные ионы, чем существующие методы, такие как диссоциация, индуцированная столкновениями. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как метод масс-спектрометрии UVPD еще не коммерциализирован. Кроме того, в данном методе используется лазер, который был интегрирован с масс-спектрометром посредством специальной модификации, выполненной до начала данной процедуры.

Соберите клетки из бактериальной культуры объемом 250 мл, центрифугируя их при 10 000 ×g в течение 10 минут при температуре 4 °C. Затем слейте супернатант среды и промойте клеточный осадок 50 мл 1× PBS. После повторного центрифугирования для осаждения клеток слейте супернатант.

Затем ресуспендируйте клетки в 40 мл 1X PBS и разделите их между двумя тефлоновыми центрифужными пробирками объемом 250 мл. Добавьте в каждую пробирку 25 мл хлороформа и 50 мл метанола для получения однофазной смеси. Перемешайте путем инверсии и инкубируйте при комнатной температуре не менее 20 минут.

Для обеспечения полного лизиса клеток центрифугируйте смесь при 2000 ×g в течение 20 минут при комнатной температуре и удалите супернатант. Промойте осадок ЛПС примерно 100 мл однофазной смеси Блайера и Дейре. Центрифугируйте при 2000 ×g в течение 20 минут и удалите супернатант.

Добавьте 27 мкл буфера для мягкого кислотного гидролиза к осадку LPS и перемешайте, несколько раз набирая и вытесняя жидкость пипеткой, пока не останутся только мелкие частицы; обработайте пробу ультразвуковым зондом для однородного ресуспендирования. Растворите осадок LPS в растворе при постоянном рабочем цикле в течение 20 секунд при 50% мощности. Повторите соникацию образца дважды: по 20 секунд каждый импульс с интервалом примерно пять секунд между импульсами.

Затем кипятите образцы на водяной бане в течение 30 минут. Извлеките пробирки из водяной бани и дайте образцам остыть до комнатной температуры. Перед тем как приступить к экстракции липида А после гидролиза, переведите раствор SDS в двухфазную смесь Блай (BLY), добавив 30 мл хлороформа и 30 мл метанола для получения смеси хлороформа, метанола и буфера для мягкого кислотного гидролиза; перемешайте путем инверсии и центрифугируйте.

Центрифугируйте образец S в течение 10 минут при 2000 ×g. С помощью стеклянной пипетки перенесите нижнюю фазу в чистую центрифужную пробирку из тефлона. После этого проведите вторую экстракцию: добавьте 30 мл нижней фазы из предварительно уравновешенной двухфазной смеси бутирата в верхнюю фазу в пробирке с образцом, перемешайте путем инверсии и центрифугируйте при 2000 ×g в течение 10 минут. Извлеките нижнюю фазу стеклянной пипеткой и объедините её с ранее извлеченной нижней фазой.

Промойте объединенные нижние фазы, добавив 114 мл предварительно уравновешенной верхней фазы BlyDire, чтобы создать двухфазную смесь BlyDire; перемешайте путем инверсии и центрифугируйте. Центрифугируйте при 2000 ×g в течение 10 минут, используя стеклянную переносную пипетку. Перенесите нижнюю фазу в чистую стеклянную колбу роторного испарителя и высушите образец методом роторного испарения.

Затем добавьте 5 мл смеси хлороформа с метанолом в роторную колбу и обработайте в ультразвуковой бане в течение не менее 30 секунд, чтобы помочь суспендировать липид A со стенок колбы. С помощью стеклянной переносной пипетки перенесите липид в чистую стеклянную пробирку, закрытую фенольной винтовой крышкой с футеровкой из A-P-T-F-E.

Высушите образец под потоком азота с помощью азотного осушителя. Ресуспендируйте высушенные липиды в 1 мл смеси хлороформа с метанолом. После добавления растворителя перемешайте смесь на вортексе для обеспечения полного ресуспендирования.

Перенесите образец в небольшой стеклянный флакон и высушите с помощью азотного осушителя. Храните высушенный образец при температуре -20 °C до проведения последующего анализа методом ТСХ или МС. Образец может храниться при температуре -20 °C до дальнейшего анализа.

После подготовки образца смешайте 200 µL метанола степени чистоты для ВЭЖХ с 200 µL хлороформа степени чистоты для ВЭЖХ в пустом маленьком стеклянном флаконе для образцов; перенесите 200 µL этой смеси растворителей хлороформа и метанола во флакон с липидом А и подвергните содержимое флакона ультразвуковой обработке в течение пяти минут или до полного растворения всего материала. Затем настройте масс-спектрометр на работу в режиме отрицательной электрораспылительной ионизации и наполните шприц объемом 250 µL раствором липида А.

Установите шприц в шприцевой насос и проведите прямое введение разбавленного липида. Образец подается со скоростью потока от 2,0 до 3,5 µL в минуту. Оптимизируйте и усильте сигнал ионов липидов путем настройки ионной оптики.

Снимите масс-спектр липида. Выделите конкретный вид и активируйте целевой липид A, выбрав CID в качестве метода MSM. Затем увеличивайте напряжение CID или нормализованную энергию столкновения до тех пор, пока не произойдет фрагментация предшественника липида.

Вид имеет относительную распространенность около 10% по сравнению с самым интенсивным ионом продукта; регистрируйте и усредняйте спектры до достижения достаточного соотношения сигнал/шум. Для анализа ионов продукта подготовьте образец и масс-спектрометр, как описано в предыдущем разделе. Включите лазер, подключенный к масс-спектрометру.

Подробную информацию о настройке масс-спектрометра см. в текстовом протоколе; настройте программное обеспечение прибора таким образом, чтобы лазер активировал эксимерный лазер в момент вхождения ионов в ячейку HCD, после чего включите импульсный генератор, чтобы лазер срабатывал каждые две миллисекунды. Изолируйте ион-предшественник липида, выбрав HCD в качестве метода MS/MS, и установите энергию столкновения на уровне 1% нормированной энергии столкновения; активируйте изолированный ион липида, увеличив энергию лазера и отрегулировав количество лазерных импульсов, которое обычно составляет десять импульсов по 6 мДж. В завершение проведите сбор и усреднение спектров до достижения достаточного отношения сигнал/шум.

Для продуктовых ионов УФ-ФД (UVPD). Масс-спектр MALDI-TOF отрицательных ионов липида А из штамма E Coli K 12 W 3 110 демонстрирует в качестве основного наблюдаемого соединения единственный депротонированный вид при отношении массы к заряду 1796.2. Подробности анализа MALDI-TOF обсуждаются в текстовом протоколе.

В качестве альтернативы, анализ того же образца липидов с использованием ESI в режиме регистрации отрицательных ионов приводит к преимущественному образованию дважды депротонированных ионов липидов с основным отношением m/z 898,1. Наблюдаются и однократно депротонированные ионы липидов с основным отношением m/z 1796,20, но их относительная интенсивность ниже, чем у дважды депротонированных форм. Фрагментация методом CID или UVPD при 193 нм проводилась для однократно депротонированного иона липида. Эти методы могут быть использованы для более точного определения химических структур, особенно липидов.

Вид, содержащий сложные комбинации модификаций или ранее не охарактеризованные химические модификации. Профили фрагментации показаны пунктирными линиями, обозначающими места расщепления, и сопоставлены со значениями главного отношения заряда, указанными под каждой представленной структурой. Значения главного отношения заряда и места расщепления, выделенные красным шрифтом, представляют собой уникальные ионы продукта, связанные с липидом, меченным UVPD 32 P.

Липид A, выделенный из двух различных штаммов E. coli K 12, был проанализирован с помощью ТСХ. Протокол данной процедуры подробно описан в текстовом протоколе. Штамм K 12 W 3 110 содержит преимущественно бис- и трисфосфорилированный липид A, или же при использовании 32P-липида наблюдается более сложная картина ТСХ.

Штамм E. coli WD 1 0 1, выделенный в ходе исследования. WD 1 0 1 вырабатывает липид, который подвергается значительной модификации рибинозой и фосфоэтаноламином.

Поскольку для модификации доступны как первый, так и четвертый primed-фосфаты, липид А из WD 1 0 1 может быть описан как однократно модифицированный, содержащий только один el-аминоарабинозу или фосфоэтаноламин у любого из фосфатов, или как дважды модифицированный, при котором оба фосфата модифицированы комбинаторным образом. Помимо модификации у первого и четвертого primed-фосфатов, наблюдается также присоединение пальмитата, что увеличивает значение RF видов липида А в данной системе растворителей. Данный протокол открыл уникальные возможности для исследователей в области микробиологии для дальнейшего изучения взаимосвязи между структурой и функцией в контексте того, как модификации липида А влияют на биологию грамотрицательных бактерий.

Мы также проявляем большой интерес и продемонстрировали эффективность масс-спектрометрии на основе UVPD для характеристики структур биологически значимых молекул, таких как гликаны, белки, нуклеиновые кислоты и другие сложные липиды. Не забывайте, что работа с органическими растворителями, биологически опасными материалами и лазерами может быть крайне опасной. Важно подчеркнуть, что работу с растворителями следует проводить в вентилируемых химических вытяжных шкафах.

Всегда следует использовать соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и защитные очки, а лазер для УФ-диссоциации (UVPD) должен быть надлежащим образом экранирован.