Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов Дрозофилы
11 сентября 2013 г.
Сотрудничество между активированной онкоген как РАН V12 и мутациями в генах клеточной полярности, как написал, приведет к росту опухоли у дрозофилы, когда опухолевые клетки также отображать инвазивных поведения. Вот простой протокол для индукции и наблюдения за доброкачественных и инвазивных опухолей представлена.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы индуцировать доброкачественные и инвазивные опухоли у дрозофил, а затем визуализировать их путем рассечения личиночного головного комплекса. Это начинается с установки между желаемыми штаммами и изоляции личиночного потомства, несущего либо инвазивные, либо доброкачественные опухоли. Следующим этапом является вскрытие выбранных личинок.
Обнажить головной комплекс, сначала разрезав их на две трети пути вниз, закрепив, а затем вывернув наизнанку. Затем жировое тело и ткани кишечника очищаются, а затем все нервы, все еще прикрепленные к вентральному нервному канатику и эпидермису личинок, также разрываются. Заключительным этапом является визуализация головного комплекса или его фиксация для последующих применений.
В конечном счете, результаты могут показать меченные GFP инвазивные или доброкачественные опухоли с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на некоторые ключевые вопросы биологии рака. Например, вы можете захотеть понять, какие гены могут препятствовать прогрессированию опухолей в интактном организме.
После того, как необходимые генетические запасы получены, подготовьте стартовую культуру тестерового штамма. Также подготовьте закваску для тестируемого подвоя. Скрестите 10 девственниц из тестера с 10 самцами из тестируемого поголовья.
Дайте мухам спариться и отложите яйца в течение 24-48 часов при температуре 25 градусов Цельсия, а затем переложите их в свежий флакон для получения большего количества потомства. Следите за перекрестными флаконами на наличие яиц и личинок первого возраста. Установите новый крест.
Если собранные флаконы показывают плохое отложение яиц. Если собранные флаконы начинают подсыхать, добавьте всего три-четыре капли автоклавной дистиллированной воды, чтобы культура оставалась влажной. Продолжайте следить за флаконами до тех пор, пока не уйдете.
Личинки третьего возраста присутствуют. Затем приступайте к их наблюдению под флуоресцентным стереомикроскопом. Используя ту же процедуру, соберите мух с инвазивными опухолями с использованием перечисленных запасов к пятому или шестому дню культивирования, блуждающие личинки третьего возраста будут доступны из культур доброкачественных опухолей.
Тем не менее, они не будут доступны до 10-го дня из инвазивных культур опухолей. Чтобы собрать личинок третьего возраста, намочите тонкую кисть дистиллированной водой и соскребите их со стенки флакона. Поместите личинок в углубление горки с холодной одной XPBS, а затем с помощью влажной малярной кисти.
Соскребите все пищевые материалы с эпидермиса. На несколько минут обездвиживания поместите личинку на тарелку при температуре минус 20 градусов Цельсия на 30 минут. Для более длительного времени иммобилизации поместите личинок во флакон с культурой, держа только муху на палочке.
Закупорьте флакон с культурой и дайте ему постоять 40 минут. Далее перенесите обездвиженных личинок на предметное стекло. Добавьте каплю легкого гало-карбюраторного масла и накройте личинок покровным стеклом.
Теперь понаблюдайте за личинками под флуоресцентным стереомикроскопом. Для выражения GFP выберите зеленые флуоресцентные личинки и приступайте к препарированию. Доброкачественные опухолевые личинки будут флуоресцировать зеленым цветом в передней области, где присутствует головной комплекс.
Инвазивные опухоли также будут флуоресцировать зеленым цветом в передней области личинок в головном комплексе. Если есть возможность, обязательно сфотографируйте флуоресцентные опухоли. Таким образом, полупрозрачный эпидермис личинки затрудняет наблюдение за степенью миграции опухолей, и именно поэтому мы должны препарировать опухоли.
Начните с использования щипцов для переноса свежей личинки с любой опухолью. Наберите в лунку для вскрытия посуду, содержащую один миллилитр холодного одного XPBS. Удерживайте личинки с помощью щипцов примерно на расстоянии двух третей от переднего конца.
С помощью другой пары щипцов разумно отделите заднюю треть личинок и выбросьте ее. Затем он отпустил передние две трети. По мере того, как давление внутри личинки сбрасывается, ее содержимое будет сочиться из полости тела.
С помощью щипцов удаляют ткани, которые сочились из полости тела. Далее придерживайте крючок для рта личинки и проталкивайте его в эпидермис личинки. С помощью другой пары щипцов полностью переверните личинки.
Теперь с помощью щипцов аккуратно и осторожно удалите жировое тело из слюнных желез, кишечника, крыльевого дискового комплекса и любых трахеальных трубок. Теперь может быть виден головной комплекс, прикрепленный к крючку для рта. Полушария мозга и ВНК по-прежнему связаны с личиночным эпидермисом через нервы, исходящие от ВНК.
Щипцами аккуратно разорвите эти соединения. Затем удалите все излишки жирового тела или других тканей, чтобы головной комплекс стал хорошо виден. Прикрепляется к личиночному эпидермису у рта крючками.
Оставьте головной комплекс как есть для дальнейшей обработки перед визуализацией. В противном случае, чтобы непосредственно визуализировать головной комплекс, отделите его от эпидермиса и поместите в каплю монтажной среды на основе глицерина, такую как векторный щит. С помощью описанного протокола были индуцированы опухоли в глазу.
Аниновый диск, доброкачественные опухоли остаются локализованными в аниновом диске глаза, где они индуцируются. Обратите внимание, что ткань, меченная GFP, не мигрировала в смежные органы, такие как вентральный нервный канатик в головном комплексе, несущем инвазивные опухоли, с 10-го дня было отмечено чрезмерное разрастание личинок опухолевой ткани. Кроме того, как указывает красная стрелка, опухоли проникли в смежные органы, такие как VNC и ротовые крючки.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как генетически индуцировать доброкачественные и инвазивные опухоли, а затем визуализировать их путем рассечения головного комплекса intra ano gastro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол индуцирования и наблюдения за доброкачественными и инвазивными опухолями у Drosophila, с особым вниманием к взаимодействию между активированными онкогенами и мутациями в генах клеточной полярности. Процедура включает препарирование цефалического комплекса личинки для визуализации характеристик опухоли.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Онкология
- Генетика
- Биология развития
Введение
- Активированные онкогены, такие как RAS V12, способствуют росту опухоли.
- Мутации в генах клеточной полярности, например scribbled, играют роль в поведении опухоли.
- Drosophila служит модельным организмом для изучения динамики опухолей.
- Понимание инвазивности опухолей имеет решающее значение для исследований рака.
Цель исследования
- Индуцировать доброкачественные и инвазивные опухоли у Drosophila.
- Визуализировать характеристики опухолей с помощью диссекции личинок.
- Изучить взаимодействие между онкогенами и мутациями полярности клеток.
Используемые методы
- Скрещивание выбранных линий Drosophila для получения потомства на стадии личинок.
- Препарирование личинок для обнажения цефалического комплекса.
- Очистка препарированных личинок от тканей жирового тела и кишечника.
- Визуализация цефалического комплекса для последующего анализа.
Основные результаты
- Успешная индукция доброкачественных и инвазивных опухолей у Drosophila.
- Визуализация характеристик опухолей посредством диссекции личинок.
- Понимание роли онкогенов и мутаций полярности клеток в поведении опухоли.
- Потенциальное значение для понимания биологии рака.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод изучения динамики опухоли у Drosophila.
- Полученные результаты способствуют пониманию инвазивности опухолей.
- Дальнейшие исследования могут быть направлены на поиск терапевтических мишеней на основе этих взаимодействий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет снизить риски при изучении механизмов путей инвазии опухоли путем моделирования перехода от доброкачественного к злокачественному росту в генетически доступной системе. Он обеспечивает валидацию мишеней посредством функционального анализа взаимодействий онкогенов и генов полярности. Этот подход повышает прогностическую точность при приоритизации генетических модификаторов поведения опухоли на ранних этапах поиска.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы, исследуя взаимодействие между активированным RasV12 и потерей генов scribble, discs large или lethal giant larvae.
- Операционная ценность: Обеспечивает биологическую оценку рисков путей инвазии посредством количественного анализа прогрессирования опухоли от локализованного очага до разрастания в прилегающие ткани.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных цефалических комплексов с опухолями для последующего фенотипического скрининга генетических супрессоров или энхансеров.
- Практическая ценность: Стандартизация процессов диссекции и визуализации для обеспечения воспроизводимых количественных показателей локализации и инвазии опухоли.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, имеющим значение для изучения заболеваний, за счет моделирования консервативных генетических взаимодействий при инвазивности опухоли, применимых к путям развития рака у человека.
- Практическая ценность: Способствует согласованию трансляционных биомаркеров, обеспечивая анализ паттернов диссоциации и миграции опухолевой ткани с GFP-меткой.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, предоставляя масштабируемую платформу для функциональной геномики в биологии опухолей.
- Фундаментальная биология: способствует уточнению путей развития за счет визуализации расширения опухоли в целых головных комплексах для оценки генетических модификаторов инвазии.
- Скрининг: обеспечивает готовность к проведению анализа посредством стандартизированной изоляции опухолевой ткани, меченной GFP, для оценки соединений или генетических супрессоров.
- Аналитика: позволяет получать количественные показатели разрастания опухоли и инвазии органов для сравнения условий на различных генетических фонах.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклинической преемственностью путем моделирования консервативных этапов прогрессирования опухоли, актуальных для систем млекопитающих.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования для валидации мишеней в рамках различных проектов в конвейерах онкологических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в моделях инвазии опухоли путем установления связи между определенными генетическими изменениями и наблюдаемыми фенотипическими результатами.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость за счет стандартизации диссекции личинок и подготовки цефалического комплекса для визуализации.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований, обеспечивая достоверную оценку фенотипа кандидатов в гены-супрессоры опухолей или онкогены на ранних стадиях.
- Влияние на портфель исследований: Помогает в приоритизации с учетом рисков, позволяя отличать доброкачественные фенотипы опухолей от инвазивных в ходе функционального скрининга.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области генетики Drosophila, флуоресцентной микроскопии и методов микрохирургического диссекирования.
- Работа зависит от наличия флуоресцентного стереомикроскопа и систем холодной анестезии для иммобилизации личинок и манипуляций с тканями.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов содержания линий, сроков скрещивания и стадирования личинок.
- При применении модели к другим типам опухолей или генетическим фонам, помимо происхождения из глазно-антеннального диска, требуются соответствующие адаптации.
- Ограничено необходимостью точного стадирования (5–6-й день для доброкачественных, 10-й день для инвазивных опухолей) для обеспечения сопоставимых окон прогрессирования опухоли.
