Создание

Общая цель данной процедуры заключается в создании модельной системы культуры in vitro для изучения внутриклеточного поведения оппортунистического грибкового патогена человека. Candida albicans в макрофагах, полученных из линии человеческих моноцитарных клеток THP-1. Для этого моноциты THP-1 сначала обрабатывают PMA для их дифференцировки в макрофаги.

Затем макрофаги THP-1 инфицируют клетками Candida GTA; через два часа после инфицирования непроглоченные клетки Candida GTA удаляют путем промывки раствором PBS. Внутриклеточные клетки Candida восстанавливают для дальнейших исследований путем осмоса инфицированных макрофагов. Данный протокол может быть использован для оценки как витальности клеток Candida GTA в макрофагах, так и процесса созревания фагосом и цитокинового ответа в макрофагах THP-1 при инфицировании Candida GTA.

Кроме того, данный протокол может быть масштабирован для полувысокопроизводительного скрининга библиотеки мутантов Candida collaborator на предмет изменения профилей выживаемости в макрофагах THP-1. Основным преимуществом этого протокола является его относительная дешевизна, высокая воспроизводимость и легкая адаптируемость к различным иммунным клеткам, а также грибковым патогенам. Чтобы начать процедуру, за два дня до инфицирования доведите моноцитарные клетки THP-1 до 80% конфлюэнтности; на первый день извлеките культуральный флакон и медленно, осторожно перемешайте его, чтобы перевести все адгезивные клетки в суспензию.

Перенесите суспензию моноцитов DHP 1 в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение четырех минут при 1000 об/мин. Слейте среду в контейнер для отходов, добавьте в пробирку 5 мл среды API и повторите процедуру. Ресуспендируйте осадок клеток THV 1, осторожно пропипетировав среду три-четыре раза.

Возьмите 10 µL клеточной суспензии для определения плотности клеток с помощью гемоцитометра и доведите плотность клеток до 1 млн клеток/мл. Добавьте в клеточную суспензию 1 µL стокового раствора PMA с концентрацией 60 µM так, чтобы конечная концентрация составила 16 нМ, и тщательно перемешайте. Раздайте по 1 мл клеточной суспензии (соответствующей 1 млн клеток) в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей и поместите его в инкубатор, настроенный на 37 °C и 5% CO2.

После 12 часов инкубации удалите старую среду. Добавьте по 1 ml среды pre RPI в каждую лунку и инкубируйте планшет еще в течение 12 часов. Эти клетки будут использованы для бактериальной инфекции, которая будет продемонстрирована далее.

Соблюдая правила микробиологической работы, инокулируйте одну колонию EA в колбу, содержащую 1 mL среды YPD. Инкубируйте колбу в течение 14–16 часов в инкубаторе при температуре 30 Degrees Celsius, после чего центрифугируйте 1 mL культуры при 4,000 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант и трижды промойте осадок клеток стерильным PBS. После удаления промывочного буфера ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл стерильного PBS путем осторожного пипетирования. Затем измерьте оптическую плотность клеточной суспензии на спектрофотометре при 600 нм и доведите плотность клеток до 2 миллионов клеток на мл с помощью PBS.

Возьмите 50 µL клеточной суспензии и разведите ее в 100 раз в PBS; высейте 100 µL культуры на среду YPD AGA методом посева на поверхность. Инкубируйте чашку при 30 °C и через один или два дня подсчитайте количество колоний, появившихся на чашке с YPD; умножьте это число на соответствующий коэффициент разведения, чтобы рассчитать количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в нулевой час. Такое количество КОЕ Canada Reta будет использовано для инфицирования макрофагов DHE.

На следующем этапе добавьте 50 µL суспензии клеток Candida albicans к монослою макрофагов в 24-луночном культуральном планшете. Встряхните планшет для равномерного распределения клеток и инкубируйте при 37 °C. После двухчасовой инкубации удалите среду, перевернув культуральный планшет над контейнером. В каждую лунку культурального планшета осторожно вдоль стенки добавьте 1 ml стерильного PBS, тщательно промойте лунки и удалите буфер.

Повторите этот шаг еще дважды. Затем, за исключением первой лунки, добавьте по 1 mL среды RPI во все остальные лунки, которые будут использоваться для мониторинга внутриклеточной репликации клеток candida atory через 4, 6, 12 и 24 часа после инфицирования. Чтобы выделить внутриклеточные клетки через два часа после инфицирования макрофагов, добавьте 1 mL стерильной воды в лунку. Через две минуты осторожно соскоблите содержимое лунки наконечником дозатора объемом 1 mL, чтобы удалить остатки макрофагов из лунки.

Промойте лунку и соберите лизат в макроцентрифужную пробирку. Приготовьте стократное разведение лизата клеток microFIT в PBS и высейте 100 µL на среду YPD AGA. Инкубируйте чашку при 30 °C в течение одного-двух дней и подсчитайте количество колониеобразующих единиц.

Умножьте это число на соответствующий коэффициент разведения, чтобы подсчитать количество клеток canida ator, фагоцитированных клетками T2 и макрофагами через два часа после инфицирования. Аналогичным образом можно определить количество внутриклеточных клеток canida ator в разные моменты времени. Пост-инфекционная внутриклеточная репликация может быть представлена как увеличение количества КОЕ через 24 часа по сравнению с количеством интернализованных КОЕ через два часа, показанных здесь.

Другие результаты типичного эксперимента, в котором общее количество клеток canida gator, инфицированных макрофагами TV one, составило 6×10⁴. Количество клеток, полученных через 24 часа, составило 3,76×10⁴. Таким образом, показано, что клетки фагоцитируются со скоростью 62,66% в течение 24-часового периода совместной инкубации.

Наблюдалось 5,2-кратное репликация всех клеток по мере увеличения числа внутриклеточных e клеток с 3,76 × 10⁴ до 1,96 × 10⁵. В данном эксперименте внутриклеточную репликацию клеток canida TER также можно оценить, используя E клетки, экспрессирующие GFP, с помощью конфокального микроскопа. Подготовьте и заразите THV и макрофаги на четырехкамерном предметном стекле, используя протокол, описанный ранее для культуральной пластины на 24 лунки.

Через два часа после инфицирования. Удалите среду, перевернув предметное стекло над контейнером для отходов, и добавьте по 500 µL PBS в каждую камеру стекла. Тщательно промойте и удалите PBS.

Повторите этот шаг еще два раза, используя по 500 µL 3,7% формальдегида для фиксации клеток. Инкубируйте препарат при комнатной температуре в течение 20 минут, затем удалите формальдегид. Промойте каждую лунку трижды 500 µL PBS для пермеабилизации макрофагов, используя 500 µL Triton X; после пятиминутной инкубации удалите Triton X и промойте лунки PBS.

Осторожно разберите камерный слайд, используя инструмент для извлечения камер и предметное стекло с воздушной подушкой. Нанесите одну каплю среды для заключения Vector Shield, содержащей DPI, на каждый сектор слайда, установите покровное стекло и загерметизируйте края лаком для ногтей; визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа. Здесь представлены репрезентативные конфокальные изображения макрофагов TP1, инфицированных клетками дикого типа Canida laboratory, экспрессирующими GFE; примерно шестикратное увеличение количества внутриклеточных клеток e в интервале от 2 до 24 часов свидетельствует о репликации Canida laboratory в макрофагах TP1. Подход с использованием сигнальных тегов (signature tag mutagenesis) широко применяется для идентификации факторов вирулентности в микробных патогенах, при котором большое количество мутантов одновременно скринируют на наличие дефектов роста с помощью уникальных олигонуклеотидных последовательностей-тегов.

Здесь мы описываем наш протокол для STM-скрининга библиотеки Канады и библиотеки мутантов, который состоит из следующих трех этапов. Сначала 96 плазмид, каждая из которых содержит уникальный стек олигонуклеотидных последовательностей, иммобилизируют на нейлоновой мембране.

На втором этапе проводится скрининг пула из 96 мутантов CANIDA ator на предмет изменения профилей выживаемости в макрофагах THV one с последующим выделением клеток мутантов из YPD, которые были выращены и интернализированы макрофагами; эти образцы будут именоваться «входными» (input) и «выходными» (output) соответственно. Наконец, проводится ПЦР-амплификация сигнатурных тегов ДНК и радиоактивное мечение образцов геномной ДНК из входных и выходных проб. ПЦР-продукт гибридизуют с уникальными тегами, после чего радиоактивные сигналы на мембране количественно определяют и анализируют.

Для сборки устройства для дот-блоттинга с 96x12 точками поместите влажную нейлоновую мембрану на увлажненную фильтровальную бумагу и затяните винты устройства. Промойте мембрану стерильной водой, затем промойте раствором 0,4 M гидроксида натрия. Перенесите 200 ng раствора PLA BDNA из блока 96x12 в соответствующие лунки устройства для дот-блоттинга после промывки 0,4 M гидроксидом натрия.

Извлеките мембрану из аппарата для анализа капель крови после переноса двух XXSC, зафиксировав перенесенную плазмидную BDNA на мембране в УФ-кросслинкере. Инкубируйте мембрану в буфере для предварительной гибридизации (antennal pre hybridization buffer) в бутылках с input и UNE в течение двух часов при 42 °C. Подготовьте радиоактивно меченые зонды методом ПЦР, используя геномную ДНК, экстрагированную из клеточных осадков input и output, и праймеры к инвертированной фланкирующей области уникальных тегов.

Денатурируйте радиоактивно меченные зонды при 99 °C в течение пяти минут, затем быстро охладите их на льду. Перенесите зонды в бутыли для ввода и вывода и инкубируйте от 14 до 16 часов при 42 °C. Послегибридизация.

Промойте входную и выходную мембраны согласно протоколу. Извлеките мембраны из флаконов, высушите их на воздухе и поместите на фосфорный экран. Через два-три часа просканируйте фосфорный экран и получите изображения.

На данном примере показаны две гибридизированные мембранные фильтры, представляющие собой скрининг одного пула из 96 мутантов canida Gatory на предмет изменения выживаемости. Количественное определение макрофагов и расчет отношения интенсивности сигнала каждого пятна на выходящей мембране к входящей мембране показали, что теги под номерами 13, 26, 75 и 85 недостаточно представлены на выходе. Эти пятна обведены красным и отражают рост четырех различных мутантов.

Напротив, мутанты в стеке с уникальными последовательностями 11 и 81, выделенными зеленым цветом, избыточно представлены в выходной пробе. Иными словами, по результатам данного скрининга из пула из 96 мутантов два мутанта должны повышать выживаемость, а четыре мутанта демонстрируют рост в макрофагах. Измененные фенотипы выживаемости, выявленные в таком пуловом скрининге, следует подтвердить в анализах с использованием единичных инфекций.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать систему in vitro для имитации условий полости рта с целью изучения профиля внутритканевого роста интересующего вас грибкового патогена. Кроме того, теперь вы сможете проводить широкомасштабный скрининг пулов мутантов с использованием данной системы.