Генерация и 3-мерная Количественное поражений артерий у мышей, используя оптической проекционной томографии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как оптическая проекционная томография может быть использована для визуализации и трехмерной количественной оценки атеросклеротических и неоинтимальных поражений у мышей. Это достигается путем создания артериальных поражений у мышей либо хирургическим путем, либо путем кормления мышами с высокой предрасположенностью к развитию атеросклероза диетой с высоким содержанием холестерина. Следующим этапом является изоляция целевой артерии и сканирование ее с помощью оптической проекционной томографии.

Заключительными этапами являются выполнение реконструкции изображения, идентификация поражения и измерение объема поражения. В конечном счете, результаты могут показать анатомическую реконструкцию поражения и количественную оценку объема поражения и артериального сужения с помощью анализа изображений. Наша группа заинтересована в понимании механизмов, лежащих в основе образования поражений, вызывающих сужение артерий, приводящее к опасным для жизни осложнениям, таким как сердечный приступ и инсульт.

Это приложение оптической проекционной томографии было разработано в нашей группе доктором Николасом Киркби в сотрудничестве с доктором Люси Лоу, и будет продемонстрировано доктором Юнг Ши Ву, научным сотрудником, работающим в наших лабораториях. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как гистология и иммуногистохимия, заключается в том, что он менее трудоемкий и позволяет проводить трехмерный, а не двухмерный анализ. Этот метод индуцирования поражения бедренной артерии модифицирован по сравнению с методами R и компании и Sada and company.

В текстовом протоколе объясняется, как вызвать атеросклеротические поражения с помощью диетических манипуляций. Начните с 10-12-недельной мыши C 57 black six весом от 25 до 30 граммов. После обезболивания поместите мышь на теплую подушку, чтобы поддерживать температуру ее тела и обеспечить изосодержание фтора в конусе от двух до 3% через носовой конус.

Когда мышь не реагирует на пощипывание пальца ноги, введите бупренорфин в дозе 0,1 миллиграмма на килограмм. Далее положите мышь на спину и сбрейте брюшную поверхность левой задней конечности. Затем сделайте разрез, чтобы обнажить мышцы верхней задней конечности между разветвлением подколенной артерии и брюшной стенкой.

Сделайте тупое рассечение, чтобы изолировать бедренный нерв от бедренной артерии и вены на протяжении всей процедуры. Поддерживайте ткани влажными с весом 1% от объема клыка. Далее поставьте временные 6,0 мерс шелковые лигатуры вокруг бедренной артерии и вены вплотную к брюшной стенке и непосредственно ниже ветви с подколенной артерией.

Они предназначены для контроля кровотока. Затем изолируют подколенную артерию, расположенную на два-пять миллиметров дистальнее ветви с бедренной артерией, и перевязывают подколенную артерию под подколенной артерией. Наложите вторую лигатуру.

Теперь сделайте небольшой разрез для введения проволоки в подколенную артерию непосредственно дистальнее ветви с бедренной артерией. Надавите на проксимальную временную лигатуру, чтобы предотвратить кровотечение через разрез в бедренную артерию по направлению к брюшной стенке. Вставьте провод G диаметром 0,014 дюйма примерно от одного до 1,5 сантиметра.

Оставьте его на месте на 30 секунд, а затем снимите. Затем с помощью лигатур перевязывают подколенную артерию над разрезом. Будьте осторожны, чтобы не закупорить бедренную артерию.

Теперь снимите временные лигатуры. Закройте рану прерывистыми идущими швами, используя 5,0 меркаля. Затем нанесите крем EMLA.

Дайте животному прийти в сознание и двигаться в реабилитационной клетке, прежде чем вернуть его в домашнюю клетку. Ожидается, что нога будет хромать в течение двух или трех дней, но это не означает, что мышь нужно изолировать. Для проведения ОПТ мышь необходимо усыпить, вызвать терминальную анестезию от пентобарбитала.

Затем делают транскардиальную перфузионную фиксацию с обескровливанием. Теперь изолируйте бедренные артерии или дугу аорты и ее ветви. В процессе удалите все посторонние периальные материалы.

Затем поместите ткань в 10% нейтральный буферный формалин на ночь. На следующий день либо хранить ткань в 70% этаноле, либо внедрять артерии в отфильтрованный 1,5% LMP aeros. Осторожно опустите ткань в расплавленный аэрос при температуре около 40 градусов Цельсия.

Обрежьте аэродинамики, чтобы получилась коническая форма. Теперь обезвоживайте этот препарат в 100% метаноле не менее 12 часов. После обезвоживания очистите сосуды в одной-двух смеси бензоспирта и бензобензоата.

Дайте сосудам поинкубироваться в этом растворе от 12 до 24 часов. На следующий день загрузите очищенный образец в томограф, который должен быть предварительно откалиброван. Разрешение установлено на уровне 1024.

На 1024 пикселя. Установите увеличение для области интереса. Ось Z будет автоматически установлена на то же разрешение.

Размер вокселя составит около 200 мкм. Затем, используя канал Brightfield, расположите образец так, чтобы он вращался вокруг своей оси в центре поля зрения. Используя один канал излучения фильтра GFP, установите фокус и отрегулируйте экспозицию, чтобы максимизировать динамический диапазон изображения.

Не допускайте перенасыщения. Теперь сканируйте сосуд в GFP по одному каналу излучения только с шагом 0,9 градуса. Затем образцы должны быть возвращены к 100% метанолу в течение не менее 24 часов перед погружением в воск.

Для гистологического анализа откройте полученные изображения в программе n recon или аналогичном программном обеспечении с помощью программного обеспечения для просмотра данных. Проверьте качество реконструкции изображения, улучшите качество изображения, отрегулируйте интенсивность изображения и попросите программное обеспечение компенсировать любое смещение образца относительно его идеальной оси вращения. Для каждого сканирования определите вертикальную область интереса, содержащую поражение.

В каждой 50-й строке сканирования прослеживайте границу между средой и положением внутренней эластичной пластинки. Затем программное обеспечение может интерполировать границу во всех других сканированиях, вручную проверить эти интерполяции и скорректировать их по мере необходимости. Теперь создайте набор двоичных изображений, в котором белые пиксели представляют неоинтиму, а черные пиксели — патентованный люмен.

Это достигается путем определения пороговых значений интенсивности. Как только это достигнуто, объем объекта — это общий объем поражения, а объем просвета — это общий объем за вычетом объема объекта. Таким образом, оценивается распределение поражения и просвета по осевой длине.

Бедренные артерии мышей были собраны через 28 дней после травмы, вызванной проволокой или лигацией. Утолщение неоинтимы было очевидно в проекциях излучения на реконструированных двухмерных слайдах. Можно выделить концентрические поражения неоинтимы.

С помощью эмиссионных изображений всей дуги аорты с помощью оптической проекционной томографии у мышей с дефицитом APOE были выявлены ожидаемые повреждения в меньшей кривизне дуги аорты, брахиоцефальной артерии, а также в истоках левой сонной и подключичной артерий. То же поражение было сегментировано и отображено красным цветом. Чтобы подчеркнуть распределение бляшек при наложении на исходное изображение, можно было различить среду и просвет на изображениях поперечного сечения, показывая, что это были эксцентрические поражения.

Здесь, по мере того, как сканирование продвигается дистально вдоль этих ветвей, поражения постепенно уменьшаются и исчезают сначала в подключичной артерии, затем в сонной артерии и, наконец, в брахиоцефальной артерии. Интересно, что это поражение брахиоцефальной артерии переходит к делителю потока, поскольку этот сосуд делится на правую сонную артерию и правую подключичную артерии. После процедуры ОПТ могут быть проведены другие методы, такие как гистология и иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каков состав поражения?

Таким образом, после своего развития этот метод проложил путь для ученых, работающих в области сосудистых исследований, чтобы исследовать роль эндотелиальных рецепторов, лектинов и ферментов, метаболизирующих стероиды, в развитии неоинтимальных и атеросклеротических поражений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получать и анализировать поражения из артерий позвоночника с помощью оптической проекционной томографии.