Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

Общая цель этой процедуры заключается в измерении общего содержания и состава жирных кислот в микроводорослях. Это достигается путем предварительной подготовки образца, содержащего известное количество биомассы лиофилизированных водорослей. Второй шаг заключается в нарушении биомассы микроводорослей.

Далее липофильные компоненты извлекаются и изолируются. Заключительным этапом является переэтерификация липидов ACell до метиловых эфиров жирных кислот. В конечном счете, газовая хроматография используется для количественного определения жирных кислот.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как тричные определения, заключается в том, что этот метод очень точен и конкретно измеряет все жирные кислоты и все другие липофильные компоненты. Демонстрировать процедуру будет NDI Afer, техник из нашей лаборатории Перед началом этой процедуры определите концентрацию сухого веса водорослей в граммах на литр в культуральном бульоне, как подробно описано в указанном справочнике. Переложите объем культуры бульона, который содержит от пяти до 10 миллиграммов сухого веса ветки в стеклянную центрифугу в пробирке.

Рассчитайте точное количество переносимой биомассы с использованием определенной ранее концентрации биомассы, центрифугируйте образец в течение пяти минут при 1200 G. Выбросьте часть надосадочной жидкости, оставив в пробирке примерно 0,25 миллилитра. Далее ресус. Суспендируйте водоросли в оставшейся надосадочной жидкости, осторожно пипетируя гранулу вверх и вниз, и переложите клеточную смесь в трубку для взбивания шариков.

С помощью пипетки объемом 200 микролитров промойте пробирку центрифуги и наконечник пипетки плюс-минус 0,15 миллилитров воды милли куба и переведите жидкость в трубку для взбивания шариков. Центрифугируйте трубку бисера в течение одной минуты на максимальных оборотах, чтобы убедиться, что на дне пробирки не осталось пузырьков воздуха. Когда закончите, после этого лиофилизируйте материал в пробирке.

Приготовьте 50 миллиграмм на литр раствора трипа Penta Deano в витаминизированном объемном соотношении хлороформа к метанолу. С помощью пипетки прямого вытеснения добавьте один миллилитр штатива, без раствора в трубку для бусин. Убедитесь, что внутри колпачка трубки отбивателя не осталось шариков, так как это приведет к утечке валика трубки.

Взбейте трубку колотушки восемь раз со скоростью 2 500 об/мин в течение 60 секунд каждый раз со 122-м интервалом между каждым валиком. Далее переложите раствор в шариках из пробирки для взбивания шариков в чистую термостойкую стеклянную центрифугу объемом 15 миллилитров с завинчивающейся крышкой с тефлоновой вставкой. Промойте трубку для взбивания шариков одним миллилитром штатива, без раствора, и переложите промывку на стеклянную центрифужную трубку.

Повторите еще два раза. Окуните образец в вихрь в течение пяти секунд, а затем обрабатывайте его ультразвуком в течение 10 минут. После ультразвуковой обработки на 2,5 миллилитра водного раствора с pH семь милликубических кубов, содержащего 50 миллимоляров трисса, и одного моляра хлорида натрия в центрифужную трубку.

После того, как образец был обработан вортексом и обработан ультразвуком во второй раз, центрифугируйте его в течение пяти минут при температуре 1200. Когда закончите, осторожно перенесите нижнюю фазу хлороформа в чистую стеклянную пробирку с помощью стеклянной пипетки для пасти, повторите экстракцию с одним миллилитром хлороформа. Когда закончите, соберите хлороформную фазу с помощью стеклянной задней пипетки и объедините ее с первой фракцией хлороформа.

Испарите хлороформ, используя поток газообразного азота, чтобы получить высушенные экстрагированные липиды. Далее добавьте три миллилитра метанола, содержащего 5% серной кислоты, в пробирку, содержащую высушенные извлеченные липиды, и плотно закройте ее. Сделайте образец вихревым в течение пяти секунд.

Инкубируйте образцы в течение трех часов при температуре 70 градусов Цельсия в блочном нагревателе. Периодически следите за тем, чтобы образцы не кипели, и закручивайте пробирку после каждой проверки образцов. После того, как образец охлаждается до комнатной температуры при трех миллилитрах милликубической воды и трех миллилитрах азота в пробирке после вихревого перемешивания.

Взбалтывайте образец в течение 15 минут с помощью вращателя пробирки. После извлечения образцов из вращателя пробирки центрифугируйте их в течение пяти минут при давлении 1200 G. С помощью стеклянной пипетки соберите два миллилитра верхней гексановой фазы и переложите ее в свежую стеклянную пробирку. Чтобы промыть собранную гексановую фазу, добавьте в стеклянную трубку два миллилитра воды milli Q.

образец в вихрь в течение пяти секунд и центрифугируйте его в течение пяти минут. При давлении 1200 G перенесите гексановую фазу из стеклянной пробирки во флакон с ГХ-флаконом с помощью стеклянной пастирующей пипетки. Затем наденьте крышку на флакон с ГХ и закрутите ее, чтобы предотвратить испарение растворителя.

Поместите флакон с образцом в автоматический пробоотборник прибора GC fit. Наконец, прогоните пробу на приборе с помощью новой колонки вызова, используя общую скорость потока 20 миллилитров в минуту и объем впрыскиваемого насоса в один микролитр. Смотрите текстовый протокол для спецификаций колонок и хроматографических условий?

Здесь показана типичная хроматограмма, полученная с помощью этого процесса. Метиловые эфиры жирных кислот разделяются по размеру и степени насыщения колонкой GC, и в протоколе используются жирные кислоты с более короткой длиной цепи и более насыщенные жирные кислоты имеют более короткое время удержания. Используемые колонка и протокол GC не предназначены для разделения изомеров жирных кислот, но это может быть достигнуто путем использования другой колонки и протокола GC.

Здесь показано содержание и состав жирных кислот C Desus UEX 3 93 как в условиях достаточного количества азота, так и в условиях его недостатка. Общее содержание жирных кислот составило 8,6 плюс-минус 0,5% и 44,7 плюс-минус 1,7% при избыточном азоте и в условиях обделения азотом соответственно. Эти значения свидетельствуют о том, что азотное голодание сильно влияет на состав и содержание жирных кислот.

В БЛРС пальмитиновая кислота и олеиновая кислота являются двумя наиболее распространенными жирными кислотами. Смотрите текстовый протокол для получения подробной информации о расчете содержания и состава жирных кислот? Здесь показано содержание жирных кислот и состав Odum Trico UEX 6 4 0 как в условиях достаточного количества азота, так и в условиях его недостатка.

Как и в случае с косыми НВ, содержание и состав жирных кислот сильно зависят от азотного голодания. В условиях достаточного и недостаточного азота общее содержание жирных кислот составляло 11,7 плюс-минус 0,9% и 30,5 плюс-минус 1,1% соответственно. P. trium также производит значительное количество высоконенасыщенных жирных кислот, таких как I csap, Penta IC кислота.

Кроме того, с помощью этого метода также могут быть обнаружены жирные кислоты с очень длинной цепью, такие как лигнеровая кислота. Эта процедура может быть расширена путем включения этапа разделения липидного сгустка между экстракцией липидов и этапом переэтерификации для получения дополнительного представления о составе класса липидов микроLG, как описано в ссылках в тексте протокола.