Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

Общая цель данной процедуры заключается в измерении общего содержания и состава жирных кислот в микроводорослях. Для этого сначала подготавливают образец, содержащий известное количество лиофилизированной биомассы водорослей. Вторым этапом является разрушение биомассы микроводорослей.

Затем проводится экстракция и выделение липофильных компонентов. Заключительным этапом является переэтерификация липидов ACell в метиловые эфиры жирных кислот. В конечном итоге для количественного определения жирных кислот используется газохроматография.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как определение общего количества липидов (tric), является его высокая точность и специфичность в измерении всех жирных кислот и всех остальных липофильных компонентов. Демонстрацию процедуры проведет NDI Afer, техник нашей лаборатории. Перед началом данной процедуры определите концентрацию сухой массы водорослей в граммах на литр в культуральном бульоне, как подробно описано в указанной ссылке. Перенесите объем культурального бульона, содержащий от 5 до 10 mg сухой массы водорослей, в стеклянную центрифужную пробирку.

Рассчитайте точное количество перенесенной биомассы, используя определенную ранее концентрацию биомассы; центрифугируйте образец в течение пяти минут при 1200 Gs. Удалите часть супернатанта, оставив в пробирке примерно 0,25 мл. Затем ресуспендируйте водоросли в оставшемся супернатанте, осторожно перемещая осадок пипеткой вверх и вниз, и перенесите смесь клеток в пробирку для гомогенизатора с шариками.

С помощью дозатора на 200 µL промойте центрифужную пробирку и наконечник дозатора ±0,15 mL воды из милли-куба и перенесите жидкость в пробирку для бид-битера. Центрифугируйте пробирку для бид-битера в течение одной минуты на максимальной скорости (RPM), чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха на дне пробирки. По завершении подвергните материал в пробирке лиофилизации согласно последующим инструкциям.

Приготовьте раствор trip Penta Deano в концентрации 50 mg/L, используя фиксированное объемное соотношение хлороформа и метанола. С помощью дозатора с положительным вытеснением добавьте 1 mL раствора tripod, no в пробирку для бисерного гомогенизатора. Убедитесь, что в крышке пробирки не осталось бисера, так как это может привести к протечке содержимого пробирки.

Проведите гомогенизацию в пробирке для бид-битера восемь раз при 2,500 RPM по 60 секунд за цикл с интервалом в 122 секунды между циклами. Затем перенесите раствор с микросферами из пробирки для бид-битера в чистую термостойкую стеклянную центрифужную пробирку объемом 15 мл с винтовой крышкой и тефлоновой вставкой. Промойте пробирку для бид-битера 1 мл раствора tripod, no solution, и перенесите промывочную жидкость в стеклянную центрифужную пробирку.

Повторите процедуру еще два раза. Перемешайте образец на вортексе в течение пяти секунд, а затем подвергните воздействию ультразвука в течение 10 минут. После соникации добавьте в центрифужную пробирку 2.5 milliliters раствора воды в Milli-Q с pH seven, содержащего 50 millimolar triss и one molar sodium chloride.

После перемешивания образца на вортексе и повторного проведения соникации центрифугируйте его в течение пяти минут при 1200. По завершении осторожно перенесите нижнюю хлороформную фазу в чистую стеклянную пробирку с помощью стеклянной пастеровской пипетки; повторите экстракцию с использованием одного миллилитра хлороформа. По окончании соберите хлороформную фазу с помощью стеклянной пастеровской пипетки и объедините её с первой хлороформной фракцией.

Испарите хлороформ потоком азота до получения сухих экстрагированных липидов. Затем добавьте в пробирку с сухими экстрагированными липидами три миллилитра метанола, содержащего 5% серной кислоты, и плотно закройте ее. Перемешайте образец на вортексе в течение пяти секунд.

Инкубируйте образцы в течение трех часов при 70 °C в блоковом нагревателе. Периодически проверяйте, чтобы образцы не закипали, и перемешивайте пробирку на вортексе после каждой такой проверки. После того как образец остынет до комнатной температуры, добавьте в пробирку 3 мл воды Milli-Q и 3 мл гексана, затем перемешайте на вортексе.

Перемешивайте образец в течение 15 минут с помощью ротатора для пробирок. После извлечения образцов из ротатора центрифугируйте их в течение пяти минут при 1200 Gs. С помощью стеклянной пастельной пипетки соберите два миллилитра верхнего гексанового слоя и перенесите его в чистую стеклянную пробирку. Для промывки собранного гексанового слоя добавьте в стеклянную пробирку два миллилитра воды milli Q.

Затем перемешайте образец на вортексе в течение пяти секунд и центрифугируйте его в течение пяти минут. При 1200 Gs перенесите гексановую фазу из стеклянной пробирки в виалу для ГХ с помощью стеклянной пастернаутовской пипетки. Затем закройте виалу для ГХ крышкой и плотно затяните ее, чтобы предотвратить испарение растворителя.

Поместите виалу с образцом в автосамплер прибора ГХ. Наконец, проанализируйте образец на приборе с использованием новой капиллярной колонки при общем расходе потока 20 milliliters per minute и объеме ввода 1 µL. См. текстовый протокол для получения сведений о характеристиках колонки и хроматографических условиях.

Здесь представлена типичная хроматограмма, полученная в результате данного процесса. Метиловые эфиры жирных кислот разделяются в колонке ГХ по размеру и степени насыщенности; при использовании данного протокола жирные кислоты с меньшей длиной цепи и более насыщенные жирные кислоты имеют меньшее время удерживания. Используемая колонка ГХ и протокол не предназначены для разделения изомеров жирных кислот, однако это может быть достигнуто при использовании другой колонки ГХ и другого протокола.

Здесь представлены содержание и состав жирных кислот C Desus UEX 3 93 как в условиях достаточности, так и в условиях дефицита азота. Общее содержание жирных кислот составило 8,6 ± 0,5% и 44,7 ± 1,7% при культивировании в условиях избытка и дефицита азота соответственно. Эти значения демонстрируют, что состав и содержание жирных кислот подвержены сильному влиянию азотного голодания.

В ESBL наиболее распространенными жирными кислотами являются пальмитиновая и олеиновая кислоты. Подробную информацию о расчете содержания и состава жирных кислот см. в текстовом протоколе. Здесь представлены содержание и состав жирных кислот Odum Trico UEX 6 4 0 как в условиях достаточного содержания азота, так и при его дефиците.

Как и в случае с косыми UUs, содержание и состав жирных кислот в значительной степени зависят от азотного голодания. При достаточном и недостаточном содержании азота общее содержание жирных кислот составило 11,7 ± 0,9% и 30,5 ± 1,1% соответственно. P trium также вырабатывает значительное количество высоконенасыщенных жирных кислот, таких как I csap, Penta IC acid.

Кроме того, с помощью этого метода можно обнаружить жирные кислоты с очень длинной цепью, такие как лигнзериновая кислота. Данную процедуру можно расширить, добавив этап отделения липидного сгустка между экстракцией липидов и этапом переэтерификации, чтобы получить дополнительные сведения о составе классов липидов микро-LG, как описано в ссылках в тексте протокола.