Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей

Общая цель этой процедуры — измерить функцию митохондрий в живых дрожжевых клетках с использованием двух зеленых флуоресцентных белков или вариантов GFP. Редокс-чувствительный GFP содержит поверхностно открытые цистины, которые подвергаются обратимому и зависящему от окружающей среды окислению и восстановлению, изменяя спектр возбуждения ряда, восстановленного белком. GFP имеет максимум возбуждения на 470 нм, тогда как окисленный ряд GFP имеет повышенный дефицит возбуждения на 365 нм.

Состояние редока измеряется как излучение RO GFP при возбуждении 470 нм над излучением RO GFP при возбуждении 365 нм go Команда представляет собой ладовой зонд, в котором эпсилонная субъединица F-нулевого F1 A TP-синтазы зажата между донором ладов GFP и акцептором ладов оранжевый флуоресцентный белок или связывание OFP TP с эпсилон-субъединицей приводит к подтверждающим изменениям в белке, которые приносят Донор и акцептор ладов находятся в непосредственной близости, что позволяет передавать энергию от донора к акцептору. Затем уровни TP измеряются как излучение OFP при возбуждении на частоте 488 нм по сравнению с эмиссией GFP при возбуждении на длине 488 нм. Получены результаты, которые отслеживают изменения окислительно-восстановительного состояния или уровня ТП, которые происходят в физиологических условиях.

Основное преимущество этих способов перед существующими методами заключается в том, что по дороге GFP и ехать. Команда генетически закодирована и может быть внедрена и стабильно поддерживаться в живых клетках. В результате их можно использовать для измерения окислительно-восстановительного состояния митохондрий и TP в живых клетках, не влияя на приспособленность ни клеток, ни органелл.

Оба зонда отслеживают изменения окислительно-восстановительного состояния или уровня TP в физиологических условиях. В результате оба датчика также являются метрическими. На измерения, выполненные с помощью этих зондов, не влияют изменения концентрации биосенсора, освещенности или толщины образца.

Оба биосенсора обеспечивают разрешение на уровне отдельных органелл. Фактически, варианты RO GFP были нацелены на митохондрии, эндосомы и пероксисомы, где они обнаруживали изменения в окислительно-восстановительном состоянии, в значительной степени независимые от pH. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в областях, касающихся контроля качества митохондрий и того, как митохондрии изменяются с возрастом.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как этапы установления пороговых значений и соотношения во время анализа изображений сложны и должны выполняться с использованием согласованных определенных руководящих принципов. Проведите трансформацию дрожжей с помощью биосенсоров, как описано в текстовом протоколе. Выращивайте клетки до середины логарифмической фазы в пяти миллилитрах селективной полной отсевающей среды в конической пробирке с коническим дном объемом 15 миллилитров.

Используйте одну и ту же партию носителя для всех экспериментов. После концентрации одного миллилитра культуры до 20 микролитров нанесите два микролитра ресуспендированных клеток на предметное стекло и накройте клетки покровным стеклом. Затем расплавьте небольшое количество ВАП на металлическом шпателе и разложите вдоль крышки по краям скольжения для герметизации.

В качестве альтернативы прозрачный лак для ногтей можно использовать для получения изображений mito RO GFP one на широкопольном флуоресцентном микроскопе. Используйте объектив с максимально возможной числовой апертурой, который пропускает свет на 365 нанометров, например, план 100 x 1,3 NA EEC. Объектив Neo Fluor.

Настройте микроскоп на возбуждение на частоте 365 и 470 нанометров для обнаружения окисленного и восстановленного углового ряда GFP соответственно. Используйте светодиоды для изменения длины волны возбуждения и куб эмиссионного фильтра, подходящий для GFP. Сняв фильтр возбуждения, установите камеру одну за другой для оптимального пространственного разрешения.

Затем настройте программное обеспечение на получение Zack, состоящего из 11 срезов с шагом 0,5 микрометра, собирая оба канала в каждой Z-позиции. Определите фокальную плоскость клеток с помощью проходящего света, чтобы свести к минимуму обесцвечивание флуоресцентного зонда. Затем соберите Z-ряд по всей глубине типичной ячейки с шагом 0,5 микрометра для подготовки к визуализации.

Может пойти команда вдвоем на спектральный конфокальный микроскоп. Используйте объектив с самой высокой числовой апертурой, доступный здесь. Используется газонный объектив с разрешением 100 x 1,49 APO.

Настройте микроскоп так, чтобы он возбуждал команду из двух человек на 488 нанометрах и собирал излучение от 500 до 520 нанометров для TP и от 550 до 580 нанометров. Для ТП несвязанные формы. Фактические оптимальные значения могут варьироваться в зависимости от характеристик системы визуализации.

Установите отверстие на 1,0 единиц площади, затем установите. Масштабирование сканирования, чтобы приблизиться к пределу выборки Найквиста. Чтобы увеличить скорость съемки, обрежьте поле до 512 на 256 пикселей.

При необходимости используйте усреднение сканирования, чтобы уменьшить шум. Используйте как можно меньше мощности лазера, при этом создавая интерпретируемое изображение. Используйте внутренний или внешний измеритель мощности для отслеживания изменений мощности лазера, которые обычно происходят с течением времени в любой оптической системе.

Отрегулируйте усиление детектора и интенсивность освещения для максимального расширения динамического диапазона. Но избегайте насыщения. Не анализируйте ячейки, содержащие более 1% насыщенных пикселей.

Определите местоположение фокальной плоскости клеток с помощью проходящего света перед сбором серии Z через глубину удержания типичной ячейки с шагом 0,5 микрометра Получите изображение всех образцов с использованием одного и того же объектива, лазерного сканирования, размера зума, пикселя, усиления и смещения. Откройте полученные изображения и измените тип на 32 бит, чтобы определить фон. Нарисуйте область интереса или ROI в области, где нет ячеек.

Выберите, анализируйте, измеряйте, чтобы добавить среднюю интенсивность этого ROI в окно результатов. Чтобы вычесть это значение из стека, выберите process math и вычтите. Затем введите среднюю интенсивность фона и выберите предварительный просмотр.

Хорошо, и да, пороговое установление является самым сложным аспектом процедуры. Чтобы обеспечить успешное выполнение, определите пороговые параметры таким образом, чтобы результирующее изображение сохраняло фактический размер флуоресцентного объекта на исходном изображении. Использование одних и тех же условий экспозиции для каждого эксперимента поможет обеспечить последовательное пороговое значение на протяжении всей обработки изображений.

Слишком низкое пороговое значение будет включать фоновые пиксели. Слишком высокий порог исключит части митохондрий из анализа с помощью вычтенного Зака, найдет средний срез и выберет корректировку изображения и порог, а затем порог митохондрий после нахождения подходящего порогового значения. Нажмите кнопку «Применить», чтобы применить это пороговое значение ко всем срезам в стеке.

Затем отметьте галочкой значение Установить пиксели фона в NAN или не число, нажмите OK и да, повторите этот процесс для другого изображения. Создайте коэффициент Z stack, нажав на процесс, а затем на калькулятор изображений. Разделите восстановленный стек на оксидированный C стек для одного анализа MIT O-R-G-F-P.

Этот же протокол используется для анализа migo AAM two. В этом случае разделите изображение A TP с горизонтом 560 нм на изображение без привязки 510 нм от A TP. Нарисуйте ROI вокруг области интереса.

Выберите инструменты анализа. Менеджер ROI и нажмите «Добавить», чтобы записать ROI, затем выберите «Больше мультимер» и «ОК». Наконец, скопируйте количество срезов площадь и среднее значение и экспортируйте данные в электронную таблицу для анализа, используйте таблицу для вычисления площади, умноженной на среднее значение взвешенной суммы и средневзвешенных клеток, экспрессирующих митохондрии целевой GFP, и ряд GFP один растет с нормальной скоростью.

Максимальная скорость роста одинакова у клеток, экспрессирующих mito GFP и MIT row GFP one. Кроме того, митохондрии и дрожжи, экспрессирующие MIT RO GF P one, имеют трубчатое выравнивание вдоль оси материнской почки и накапливаются на концах материнских и дочерних клеток. Эта нормальная морфология указывает на то, что MIT RO GF P one не нарушает функцию митохондрий.

Для оценки динамического диапазона mitg FP с одной средней фазой дрожжевых клеток дикого типа обрабатывали перекисью водорода и дихи-тремя этолом, а среднее соотношение митохондриальных восстановленных к окисленным измеряли для оценки митохондриального окислительно-восстановительного состояния: титрование перекисью водорода или DTT от нуля до 10 миллимоляров приводит к дозозависимому изменению. В среднем митохондриальное отношение восстановленных к окисленным с измеряемым диапазоном от 0,6 в окислительных условиях до 1,23 в восстановительных условиях. Таким образом, mitg FP one является эффективным биосенсором для анализа митохондриального редата в живых клетках.

Mito RO GFP one также обеспечивает субклеточное разрешение окислительно-восстановительного состояния митохондрий. Это субклеточное разрешение показывает, что митохондрии в отдельных дрожжевых клетках различаются по относительному окислительно-восстановительному состоянию: свет может вызывать изменения в четверке хромо GFP: при воздействии 400-нанометрового светового ряда высокой интенсивности GFP one претерпевает фотоконверсию в вещества с другим спектром излучения с использованием возбуждения низкой интенсивности. За анализируемый период существенной конверсии фотографий не наблюдается.

Предпочтительным способом снижения фотоконверсии является возбуждение окисленной формы ряда GFP на 365 нм MIGO AAM two co локализуется с DAPI окрашенной митохондриальной ДНК в дрожжах и обнаруживается в трубчатых структурах, типичных для митохондрий дрожжей дикого типа. Кроме того, скорость роста клеток, экспрессирующих MIGO AAM two, аналогична скорости роста клеток, экспрессирующих митохондрии нацеленный GFP как в глюкозной, так и в глицериновой среде. Таким образом, экспрессия migo A 2 не является вредной для клетки или митохондрий, чтобы проверить, реагирует ли migo A 2 на изменения уровня митохондриального A TP. Клетки были обработаны антимицином А, агентом, который ингибирует выработку митохондриального A TP.

Медианное соотношение ладов уменьшается в клетках, обработанных антимицином. Интересно, что предварительные данные указывают на то, что могут быть различия в уровнях TP в разных митохондриях в пределах одной и той же клетки. Однажды, освоив эту технику, ее можно выполнить за несколько часов.

Кроме того, при попытке проведения этой процедуры важно поддерживать постоянные параметры визуализации, контролируя клетки на предмет фрагментации митохондрий и других признаков фототоксичности. Избегайте фотообесцвечивания и разработайте последовательные критерии для порогового значения. Эти биосенсоры могут быть использованы для мониторинга митохондриальных изменений в живых растительных грибах и клетках млекопитающих.

Они также могут быть использованы для мониторинга митохондриальных изменений при нейродегенерации, метаболических заболеваниях и других заболеваниях, связанных с дефектами митохондриальных функций. После просмотра этого видео вы сможете использовать митохондриальные флуоресцентные красители с целевым отношением для мониторинга окислительно-восстановительного состояния митохондрий и TP в живых клетках.