Матрица-лазерной десорбцией / ионизацией Время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрический анализ интактных белков Больше, чем 100 кДа

Общая цель этой процедуры заключается в анализе интактных белков размером более 100 килодальтон чувствительным образом с помощью масс-спектрометрии Мальди. Это достигается путем предварительной подготовки матричных решений. Второй шаг — нанесение тонкого слоя раствора на мишень.

Далее образец и смесь матриц наносятся на мишень. Заключительным этапом является наблюдение за пятнами образца под микроскопом. В конечном счете, мультимасс-спектрометр используется для анализа интактных белков и записи масс-спектров.

Основное преимущество масс-спектрометрии maldi перед другими аналитическими подходами, такими как ионизация электрораспылением, заключается в том, что она более устойчива к соли, загрязнениям и моющим средствам. Еще одним преимуществом maldi является то, что он генерирует ионы, несущие меньше зарядов по сравнению с электрораспылением. Таким образом, получение и интерпретация данных MDI довольно просты.

Чтобы начать кристаллизацию ореха, налейте 10 миллилитров 40%-ного этанола в форму Pyrex. Затем на 600 миллиграмм матрицы с помощью водяной бани и резистивного нагревателя. Подогрейте раствор матрицы и размешайте его до полного растворения матрицы.

Повторяйте предыдущие шаги до тех пор, пока раствор не пропитается. Дайте раствору медленно остыть при комнатной температуре в течение нескольких часов, а затем храните при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Если кристаллы не образуются, поцарапите внутреннюю часть стакана чуть ниже поверхности раствора, используя стеклянный стержень, чтобы вызвать кристаллизацию.

Наконец, соберите кристаллы матрицы с помощью фильтрации. Остатки кристаллов в колбе промойте минимальным количеством ледяного растворителя и отфильтруйте их. После завершения фильтрации дайте кристаллам высохнуть, чтобы очистить целевую пластину maldi.

Промойте его метанолом и аккуратно протрите салфеткой. Затем промойте его водой и протрите салфеткой ким. Вставьте мишень maldi в стакан объемом 600 миллилитров и покройте его 50% этанолом.

Далее обработайте мишень ультразвуком в растворе этанола в течение 10 минут в ультразвуковой ванне. Если на пластине остались остатки, повторите предыдущие действия. Промойте мишень метанолом или водой, в которой используется растворитель, определяет, насколько растекается образец.

Затем наклоните мишень так, чтобы вся жидкость собралась на салфетке Кима. Высушите мишень с помощью потока газообразного азота. На следующем этапе растворите альфа CHCA в ацетоне.

Для того чтобы приготовить насыщенный раствор, окуните наконечник пипетки объемом 10 микролитров в насыщенный раствор альфа-CHCA так, чтобы небольшое количество раствора потекло в наконечнике. Быстро коснитесь мишени maldi наконечником пипетки, чтобы нанести раствор альфа-CHCA на мишень maldi с помощью пластиковой трубки объемом 1,5 миллилитров. Приготовьте 20 мг на миллилитр раствора альфа-CHCA, растворив альфа-CHCA в соотношении 7:3 объема ацетонитрила и 5% муравьиной кислоты, обозначенном как раствор альфа-CHCA.

После этого приготовьте раствор DHB в дозе 20 мг на миллилитр, растворив DHB в соотношении 7:3 объема ацетилнитрила до 0,1% трифторуксусной кислоты, помеченный как раствор DHB. Смешайте раствор alpha CHCA и раствор DHB в соотношении объема один к одному. Для получения раствора C-H-C-A-D-H-B до начала этой процедуры необязательным шагом является очистка образцов белка с помощью буферного обмена, показанного в указанном справочнике.

В противном случае поместите неочищенный образец белка на мишень MALDI. Далее нанесите 0,5 микролитра образца белка на подготовленный тонкий слой альфа CHCA. Сразу после этого добавьте 0,5 микролитра раствора C-H-C-A-D-H-B.

Нанесите на пластину MALDI 0,5 микролитра стандарта Cain, а затем добавьте 0,5 микролитра матричного раствора. После того, как образцы и каин высохнут, вы можете рассмотреть пятна под микроскопом, вставить мишень в инструмент и выбрать подходящую конфигурацию инструмента. Затем выберите подходящий диапазон соотношения массы к заряду.

Получите спектры ca и откалибруйте прибор с использованием соответствующей интенсивности лазера. Получите спектры образцов белка. Здесь показан анализ MALDI toff интактного участка хромосомы Поддержание одного белка.

Смесь C-H-C-A-D-H-B давала масс-спектры более высокого качества с точки зрения отношения сигнал/шум и чувствительности. В частности, можно было обнаружить 0,5 пикомоле белка, осажденного на мишень MALDI, в то время как такое же количество белка было едва ли обнаруживаемо С использованием SINO NIC кислоты с использованием смеси C-H-C-A-D-H-B наблюдались многократно заряженные ионы белка, что позволило определить массу с более высокой точностью, поскольку пиковое разрешение обратно пропорционально коэффициенту основного заряда в случае осевого мультитонального прибора. Кроме того, при использовании смеси C-H-C-A-D-H-B мы выбрали метод матричного осаждения методом тонкого слоя.

При использовании метода высушенных капель белки с массой более 100 килодальтон не обнаруживались. Мономерный бета-коллекционный белок аазы также был проанализирован с помощью multi TOF. Спектры C-H-C-A-D-H-B были лучше, чем спектры SINO NIC кислот с точки зрения чувствительности и разрешения.

Кроме того, присутствие многократно заряженных ионов позволило подтвердить массу белка с более высокой точностью. MALDI к анализу интактного иммуноглобулина приведен здесь. Спектры, полученные с использованием смеси C-H-C-A-D-H-B, были значительно более интенсивными, чем спектры SA и альфа CHCA.

В частности, сигналы белков были выше и имели лучшее разрешение в спектрах C-H-C-A-D-H-B. Использование смеси C-H-C-A-D-H-B и метода тонкого слоевого осаждения продемонстрировало значительное улучшение качества крупного интактного белка. Масс-спектры получены с помощью MALDI to instrument.

Представленный протокол иллюстрирует, как получить высококачественные масс-спектры высокомолекулярных белков с помощью мультиинструмента. При проведении такого рода анализа важны три вещи. Во-первых, использовать свежеприготовленное решение для метрик.

Во-вторых, правильно поместить образец на цель в Мали. И в-третьих, использовать соответствующую инструментальную настройку, такую как интенсивность лазера.