Вперед генетические подходы в

Общая цель данной процедуры заключается в проведении генетического анализа Chlamydia trachomatis путем химического мутагенеза и определения ассоциаций между генотипом и фенотипом. Это достигается путем первоначального создания мутантных штаммов Chlamydia trachomatis с помощью химического мутагенеза. Затем все вызванные химическим воздействием мутации идентифицируются с помощью полногеномного секвенирования с последующей сборкой генома по референсу.

Затем определяются ассоциации между фенотипом и генотипом в мутантных штаммах. Наконец, эти ассоциации подтверждаются путем создания рекомбинантных штаммов и их анализа. В конечном итоге, благодаря сочетанию классических методов химического мутагенеза и секвенирования следующего поколения, могут быть получены результаты, демонстрирующие, что мутация в конкретном гене хламидии приводит к интересующему фенотипу.

В настоящее время методы замены генов у хламидий отсутствуют, а молекулярно-генетический инструментарий для их изучения находится на начальном этапе разработки. Данный метод не требует трансформации рекомбинантной ДНК или создания специальных молекулярно-генетических инструментов, однако позволяет достичь той же цели, а именно — определения функций отдельных продуктов генов.

Для подготовки культур клеток высейте примерно 1 × 10⁶ клеток на 25 см² в 3 мл DMEM с добавлением 10% FBS и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. Когда клетки достигнут конфлюэнтности примерно через 24 часа, аспирируйте среду и инфицируйте клетки хламидиями с множественностью заражения 5 в общем объеме 3 мл DMEM-FBS, содержащего 200 нг/мл циклогексимида. Для начала мутагенеза через 18 часов после инфицирования в вытяжном шкафу приготовьте раствор этилметансульфоната (EMS) в концентрации 20 мг/мл в PBS с добавлением хлорида кальция и хлорида магния.

EMS является сильным мутагеном и канцерогеном. Поэтому правила его утилизации изложены в текстовом протоколе. Отсосите среду с клеток Vero и один раз промойте их тремя миллилитрами PBS с хлоридом магния и хлоридом кальция.

Затем добавьте 3 мл раствора EMS и инкубируйте в течение одного часа в вытяжном шкафу при комнатной температуре. После инкубации удалите EMS и поместите образец в контейнер с 1 М раствором гидроксида натрия для инактивации мутагена, после чего промойте клетки трижды для удаления остатков EMS. Затем добавьте 6 мл DMEM с 10% FBS, содержащего 200 нг/мл циклогексимида и 25 мкг/мл гентамицина, и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 48–72 часов.

Примерно через 36 часов после мутагенеза (на 72-м часу) включения кажутся лишенными бактерий. Около 10% включений заполнены бактериями, в то время как остальные остаются пустыми. Для извлечения элементарных телец (ЭТ) путем гипотонического лизиса полностью аспирируйте среду. Добавьте 1 мл воды и перемешивайте на качалке в течение 10 минут, чтобы отделить клетки, затем лизируйте клетки, прокачивая их через пипетку вверх-вниз не менее 10 раз.

После сбора лизата в микроцентрифужную пробирку добавьте 0,25 миллилитра пятикратного сахарозо-фосфат-глутаматного буфера (SPG) до конечной концентрации однократной и храните при температуре -80 °C. Создайте сплошные монослои клеток VES в 6-луночных планшетах, посеяв примерно 0,4 × 10⁶ клеток в 3 миллилитрах среды DMEM с 10% FBS на лунку; дайте клеткам сформировать гомогенный монослой в течение следующих 24 часов. Затем на льду разморозьте стоковый раствор мутагенной хламидии.

Затем подготовьте шесть пробирок с десятикратными серийными разведениями в общем объеме 200 µL на каждое разведение в среде DMEM с 10% FBS и поместите их на лед. Используйте по 3 mL PBS на лунку, чтобы дважды промыть клетки Vero. Затем добавьте по 3 mL DMEM в каждую лунку 6-луночного планшета и по 100 µL бактериального разведения в двух повторностях.

Повращайте планшет круговыми движениями для обеспечения равномерного перемешивания. Центрифугируйте инфицированные планшеты при 2 700 GS в течение 30 минут при 15 °C. Затем инкубируйте их при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% carbon dioxide в течение одного-двух часов.

Тем временем приготовьте 0.54% AROS в среде DMEM, сначала объединив и перемешав следующие ингредиенты. Затем добавьте 18.9 мл горячего стерильного 1.2% раствора AROS в воде, постоянно помешивая во избежание образования комков. Поддерживайте смесь в теплом состоянии на водяной бане при температуре 55 °C.

Отоссем бактериальную суспензию из чашек и добавьте шесть миллилитров теплого раствора aro. Дайте ему полностью затвердеть при комнатной температуре вне вытяжного шкафа. Затем, сняв крышки, просушите чашки в боксе биологической безопасности еще в течение 15 минут; после высыхания чашек инкубируйте их при 37 °C в CO₂-инкубаторе от семи до 10 дней.

Пlaques должны стать видимыми при помощи стереомикроскопа за один день до выделения мутантов. Засейте 1×10⁴ клеток в 100 µL на лунку. В 96-луночном планшете клетки достигнут конфлюэнтности в течение 24 часов.

Под диссекционным микроскопом отметьте бляшки, которые необходимо выделить, затем с помощью стерильной барьерной пипетки объемом 1 мл соберите пробки с бляшками. Ресуспендируйте бляшки в 100 µL среды DMEM, дополненной 10% FBS, 400 ng/mL циклогексимида и 50 µg/mL гентамицина, для экспансии мутантных штаммов; нанесите полученную суспензию на конфлюэнтные монослои клеток Vero.

Центрифугируйте планшеты при 2 700 g и 15 °C в течение 30 минут перед инкубацией; сбор клеток производят, когда более 50% клеток инфицированы, что может произойти в интервале от 48 часов до 14 дней после инфицирования. Такое количество инфицированных клеток позволяет сохранить достаточное число жизнеспособных бактерий для экстракции EV путем гипотонического лизиса инфицированных клеток. После аспирации среды добавьте 160 µL стерильной воды и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Используйте наконечники с фильтром для разрушения клеток, несколько раз пропипетируя содержимое вверх-вниз для обеспечения полного лизиса. Затем перенесите по 160 µL каждого лизата в микроцентрифужные пробирки. Добавьте 40 µL пятикратного XSPG и храните при температуре -80 °C до проведения анализа и скрининга мутантов на наличие интересующих фенотипов.

Воздействие мутагена приводит к появлению включений, которые кажутся лишенными бактерий, предположительно из-за гибели бактериальных клеток. Обычно серовар LGVL two полностью лизирует инфицированные клетки в течение 48 часов после инфицирования, но обработка мутагенами может увеличить этот цикл до более чем 90 часов, и в наших экспериментах ожидается восстановление примерно 10% включений. Инфицированные клетки Vero, обработанные 20 mg/mL EMS, привели к 99% снижению восстановления инфекционного потомства по сравнению с необработанным контролем, как показано на этом рисунке.

Обработка мутагеном также привела к появлению бляшек с измененной морфологией, включая мелкие бляшки. Другие варианты морфологии включают бляшки с гранулярным, комковатым или сотообразным видом, как показано здесь. Дозы EMS, использованные в этих исследованиях, могут приводить к возникновению от трех до 30 мутаций на геном KCL, что было подтверждено экспериментально с помощью NGS.

Хотя EBS, очищенные методом градиента, в значительной степени свободны от материала клеток-хозяев, в них также обнаруживается ДНК хозяина, которая составляет около 10–15% геномных препаратов после проведения данной процедуры. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, какие бактериальные факторы необходимы для формирования и поддержания патогенных факторов хламидий, можно провести скрининг таких фенотипов, как нарушение репликации в культурах тканей, утрата биохимической активности или изменение морфологии бактерий.