Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры

Общая цель данной процедуры заключается в оценке транспорта системы доставки лекарственного средства или терапевтического агента. Она осуществляется через клеточный барьер, например, модель эпителия желудочно-кишечного тракта, имеющую значение для пероральной доставки лекарств. Это достигается путем предварительного культивирования клеток Caco-2 на вставках Transwell для обеспечения дифференцировки клеток и формирования клеточного монослоя.

Вторым этапом является подтверждение того, что данная модель представляет собой проницаемый барьер, путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления, иммуноокрашивания клеточных контактов и оценки пассивной проницаемости детектируемой молекулы-трассера. Следующий шаг — подготовка системы доставки лекарственного средства; в данном примере используются таргетные полимерные наноносители. Носители могут содержать лекарственный препарат или нет; также необходимо включить контроли, такие как нетаргетные носители или свободный препарат.

Эти элементы метят радиоизотопами для обеспечения возможности их обнаружения. Затем, после инкубации, носители добавляют в апикальную камеру над монослоем клеток. Через определенные промежутки времени носители собирают из апикальной камеры, базолатеральной камеры и монослоя клеток, после чего проверяют на возможную деградацию меченого компонента.

Затем, для изучения механизма транспорта, рассчитывается перенос наноносителей через клеточный монослой. Аналогичные эксперименты следует провести в присутствии фармакологических ингибиторов трансцитоза через клетки или с использованием репортеров парацеллюлярного транспорта между клетками. Описанный здесь метод является адаптацией общепринятых подходов, используемых для оценки скорости и механизма транспорта лекарственных веществ и наноносителей через культуральные клеточные монослои, которые имитируют клеточные барьеры в организме.

Хотя приведенный здесь пример подтверждает транспорт таргетных полимерных наночастиц через модель эпителия желудочно-кишечного тракта, аналогичные методы могут быть применены для изучения прохождения различных систем доставки лекарств через эти или иные монослои клеток, например, через эндотелиальные клетки, которые обычно формируют барьер между кровотоком, тканями и органами. Например, в случае гематоэнцефалического барьера. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями из-за сложности выбора меток для надлежащего отслеживания систем доставки лекарств в таких исследованиях, особенно если они транспортируются через клетки в небольших количествах.

В данном аспекте для маркировки систем доставки лекарств в наших исследованиях мы будем использовать радиоизотопы; еще одной важной задачей является проверка целостности барьера из модельных клеток и использование соответствующих контролей для подтверждения этого в ходе экспериментов. Данная процедура выполняется в стерильном шкафу для культивирования клеток второго уровня биобезопасности, и все материалы, помещаемые в шкаф, должны быть стерилизованы этанолом; с помощью пинцета поместите полиэтилентерефталатные вставки Transwell с порами 0,8 µm в 24-луночный планшет для получения статистически значимых результатов.

Для каждого экспериментального условия требуется минимум четыре повторности. Разведите клетки эпителиальной колоректальной аденокарциномы человека или клетки Caco-2 в предварительно приготовленной клеточной среде. Поместите от 200 до 400 µL клеточного раствора в верхнюю или апикальную камеру трансвелла.

Высейте клетки с плотностью 1,5 × 10⁵ клеток на квадратный сантиметр. Заполните нижнюю или базалатеральную камеру 700–900 µL культуральной среды. Культивируйте клетки при 37 °C, 5% CO₂ и 95% влажности в течение 16–21 дня, заменяя среду в верхних и нижних камерах каждые три-четыре дня.

Замените среду в следующем порядке, чтобы поддерживать давление над монослоем клеток: аспирируйте среду из нижней камеры, затем аспирируйте среду из верхней камеры. Наполните верхнюю камеру от 200 до 400 µL свежей среды и наполните нижнюю камеру от 700 до 900 µL свежей среды, чтобы проверить барьер проницаемости эпителия. Переключите вольт-омметр в режим измерения сопротивления и вертикально поместите электроды в лунку с вставкой Transwell.

Короткий электрод должен находиться в верхней камере, а длинный электрод — в нижней камере, касаясь дна лунки. После стабилизации показаний вольтметра запишите значение сопротивления в омах для каждой лунки. Повторяйте измерения каждые один-два дня до тех пор, пока значения не достигнут максимума и не выйдут на плато, что указывает на формирование барьера проницаемости; обычно это занимает от двух до трех недель с момента посева клеток.

Для подтверждения наличия плотных соединений в монослоях клеток с высоким уровнем экспрессии сначала зафиксируйте клетки, аспирируйте среду из обеих камер и трижды промойте клетки теплым DMEM, затем инкубируйте с холодным 2% параформальдегидом в течение 15 минут. Через 15 минут удалите параформальдегид и трижды промойте клетки PBS. Далее в каждую камеру добавьте антитела к окклюдину в концентрации 1 µg/mL.

Используйте лунки с низкой степенью разрыва в качестве отрицательного контроля формирования барьера. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут снова промойте клетки PBS, затем добавьте в каждую лунку меченые вторичные антитела в концентрации 7,5 µg/mL и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Наконец, промойте клетки PBS и осторожно вырежьте фильтрационную мембрану, к которой прикреплен фиксированный монослой; закрепите ее на предметных стеклах для визуализации с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.

Данная процедура начинается с мечения таргетного антитела йодом 1 25 и расчета удельной активности меченого антитела в импульсах в минуту на микрограмм в соответствии с ранее опубликованными протоколами. В данном примере в качестве таргетного антитела используется мышиное моноклональное антитело к молекуле межклеточной адгезии человека 1 или анти-ICAM one для контроля специфичности. Мышиный IgG, меченный йодом 1 25, будет использован для подготовки нетаргетных покрытых наноносителей для изучения транспорта терапевтического груза.

Груз также метят йодом 125. В данном примере в качестве груза используется альфа-галактозидаза A (Alpha G) — терапевтический фермент, применяемый для лечения болезни Фабри, генетического заболевания из группы лизосомных болезней накопления. Одним из наиболее сложных аспектов этой процедуры является обеспечение адекватного обнаружения транспортируемых материалов.

Для обеспечения успеха компоненты наноносителей должны быть помечены достаточным количеством изотопов с высокой удельной активностью. Следующим шагом является связывание меченого анти-ICAM с поверхностью наноносителей. В данном случае мы просто смешиваем меченый iodine 1 25 анти-ICAM с полистирольными наночастицами диаметром 100 nanometer, которые используются в качестве модели для неспецифического контроля.

Используйте IgG, меченные иодом-125, и для отслеживания транспорта груза используйте комбинацию анти-ICAM и Alpha G, меченных иодом-125. Инкубируйте смеси в течение одного часа при комнатной температуре для обеспечения поверхностной адсорбции; через один час центрифугируйте при 13 000 g в течение трех минут, затем удалите неактивные компоненты из супернатанта с помощью аспирационной пипетки. Чтобы суспендировать осадок, содержащий покрытые наноносители, используйте 1% бычий сывороточный альбумин в PBS, после чего проведите соникацию на низкой мощности для разрушения возможных агрегатов частиц. Добавьте наноносители анти-ICAM, меченные иодом-125, в верхнюю камеру над конфлюэнтными монослоями Caco-2 с высоким титром. Повторите процедуру для неспецифических и терапевтических аналогов после измерения титра.

Инкубируйте при 37 °C в течение одного или нескольких выбранных временных интервалов. После инкубации повторно измерьте величину разрыва. Измерения разрыва проводятся для оценки влияния наноносителей на проницаемый барьер.

Соберите среду из верхней и нижней камер. Промойте верхнюю камеру 0.5 milliliters DMEM при 37 °C, а нижнюю камеру — одним миллилитром деионизированной воды. Соберите промывочные растворы для определения общего содержания радиоизотопа с помощью гамма-счетчика для измерения клеточной фракции.

Вырежьте проницаемый фильтр, используя лезвие бритвы для разрезания по краям. Инкубируйте его в пробирке для гамма-счетчика с 1% Triton X 100 в течение 10 минут для высвобождения содержимого клеток перед измерением общей радиоактивности, связанной с клетками, чтобы определить количество iodine 1 25, высвобожденного из наноносителей во время транспорта или вследствие возможной деградации. Сначала смешайте 300 µL каждого образца с 700 µL 3% BSA в PBS и 200 µL трихлоруксусной кислоты (TCA), затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.

В течение этого 15-минутного периода инкубации измерьте общую радиоактивность образцов с помощью гамма-счетчика; центрифугируйте образцы с ТХА при 3000 g в течение пяти минут, чтобы отделить неповрежденный белок от деградированного белка или фракции иода-125. Определите количественно радиоактивность фракции свободного иода-125 и вычтите это значение из общей радиоактивности, измеренной до центрифугирования. Это позволит определить количество меченого белка по сравнению с фракцией радиоактивного индикатора, отделившегося от него. Для оценки парацеллюлярного транспорта с использованием утечки альбумина через парацеллюлярный путь культивируйте монослои KCO2 на вставках Transwell, как было продемонстрировано ранее, в среду верхней камеры над монослоем клеток добавьте либо только альбумин, меченный иодом-125, в качестве отрицательного контроля для демонстрации базового уровня утечки, либо иод.

Альбумин, меченный 1 25, и нерадиоактивно меченные антитела. Нацеленные наноносители инкубируют при 37 °C в течение выбранных интервалов времени, которые должны соответствовать интервалам, использованным при тестировании nz.Transport. Измеряют уровень слезотечения, как было продемонстрировано ранее, до, во время и после инкубации.

Соберите все фракции после инкубации для измерения общего йода 1 25 и свободного йода 1 25 в качестве положительного контроля открытия межклеточных соединений. Добавьте в верхнюю и нижнюю камеры трансвелла культуральную среду, содержащую 5 мМ перекиси водорода. Установите и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.

Измерьте ТЭР и добавьте йод-125-альбумин в верхнюю камеру на выбранные интервалы времени. Измеряйте ТЭР в разные моменты времени на протяжении всей инкубации, чтобы определить снижение значения ТЭР, вызванное перекисью водорода вследствие раскрытия межклеточных контактов. В параллельных экспериментах оцените трансклеточный транспорт или трансцитоз наноносителей, нацеленных на йод-125, путем инкубации конфлюэнтных монослоев Caco two с каждым из этих ингибиторов.

50 мкМ MDC, ингибитор клатрин-опосредованного эндоцитоза. 1 мкг/мл филипина, ингибитор клатрин-опосредованного эндоцитоза. 0,5 мкМ WT манина, ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы, участвующей в макропиноцитозе, и 20 мкМ EIPA.

Для дополнительного контроля влияния ингибиторов на проницаемость монослоя и подтверждения валидности монослоев Caco-2 как модели трансэпителиального транспорта таргетных наноносителей измеряли ТЭР (трансэпителиальное электрическое сопротивление) до, во время и после инкубации клеток с ингибиторами макропиноцитоза и клатрин-опосредованного эндоцитоза, а также с радиоактивно меченными материалами. Клетки Caco-2 выращивали на вставках Transwell с плотностью 1,5 × 10⁵ клеток на см², при этом ТЭР измеряли для оценки целостности монослоя. Как показано на данном графике, монослой достиг конфлюэнтности к 12-му дню и сохранял свою целостность до 18-го дня. Этот результат был дополнительно подтвержден наличием окклюдин-положительных плотных контактов в монослоях с высоким значением ТЭР (380 Ом·см²) на 14-й день по сравнению с ограниченным окрашиванием плотных контактов при низком значении ТЭР (17 Ом·см²). На 5-й день для оценки транспорта наноносителей анти-ICAM через монослои клеток Caco-2 конфлюэнтные монослои Caco-2, выращенные на вставках Transwell, инкубировали с наноносителями анти-ICAM, меченными йодом-125, которые добавляли в апикальную камеру.

Содержание Iodine 1 25 в базолатеральной камере измеряли в указанные моменты времени, чтобы рассчитать количество наноносителей, транспортированных на одну клетку, как показано на верхней панели; на нижней панели процент транспортированных наноносителей рассчитывали как отношение количества носителей, обнаруженных в базолатеральной фракции, к количеству в объединенной базолатеральной и клеточной фракциях. Эти параметры, рассчитанные в данном примере для наноносителей Iodine 1 25 anti ICAM, также сравнивали с параметрами контрольных наноносителей Iodine 1 25 IgG, чтобы продемонстрировать эффективность транспорта по сравнению с нетаргетным аналогом; результаты представлены на верхней панели.

Также были рассчитаны коэффициенты кажущейся проницаемости, отражающие скорость транспорта наноносителей anti-ICAM с ¹²⁵I или наноносителей IgG с ¹²⁵I, как показано на нижней панели, когда радиоактивная метка включена в груз наноносителя. Описанные параметры отражают транспорт груза, которым в данном примере является фермент альфа-галактозидаза А, используемый для лечения генетического лизосомного заболевания накопления, известного как болезнь Фабри. Содержание радиоизотопа в апикальной, базолатеральной и клеточных фракциях измеряли через 3 часа и 24 часа, после чего значения были пересчитаны в различные показатели транспорта, представленные в данной таблице.

Помимо расчета транспорта наноносителей путем отслеживания груза, трансэпителиальная доставка этого терапевтического фермента может быть оценена путем выражения количества перенесенных молекул или пикограммов Alpha-gal на клетку. Также был исследован механизм транспорта наноносителей anti ICAM через монослои Caco. Трансцеллюлярный транспорт наноносителей iodine 1 25 anti ICAM через конфлюэнтные монослои Caco two оценивали через 24 часа в отсутствие или присутствии следующих ингибиторов: EIPA, Filipin, MDC или Wortmannin. EIPA является ингибитором макропиноцитоза и кавеола-опосредованного эндоцитоза. Filipin, MDC и Wortmannin являются ингибиторами клатрин-опосредованного эндоцитоза, клатрин-опосредованного эндоцитоза и макропиноцитоза соответственно.

Как показано на этом графике, EIPA снижал транспорт наноносителей анти-ICAM с йодом 1 25 через монослои клеток Caco-2. В то время как филлипин MDC и виртманнин не снижали уровни транспорта по сравнению с контрольной группой. Это позволяет предположить, что наноносители анти-ICAM используют кавеола-опосредованный эндоцитоз для трансцеллюлярного транспорта, но не используют клатрин-зависимый или связанный с макропиноцитозом трансцитоз.

Для оценки парацеллюлярного транспорта при переносе наноносителей анти-ICAM-1 $^{125}\text{I}$ через монослои Caco-2 измеряли ТЕР (трансэпителиальное электрическое сопротивление). В качестве контроля представлены значения ТЕР в отсутствие наноносителей; пунктирный интервал обозначает SEM среднего значения. Инкубация с 5 мМ перекисью водорода служила положительным контролем раскрытия межклеточных соединений, что отразилось в снижении ТЕР до базальных уровней.

Кроме того, была измерена и рассчитана утечка белков через парацеллюлярный путь, определяемая как коэффициент кажущейся проницаемости йодированного альбумина 125 при пересечении клеточного монослоя в отсутствие или присутствии 5 мМ перекиси водорода, наноносителей IgG или наноносителей анти-ICAM. Перекись водорода значительно усиливала утечку йодированного альбумина 125 в базально-латеральную камеру и служила положительным контролем, как показано на этих графиках. Инкубация с наноносителями анти-ICAM не изменяла парацеллюлярную утечку йодированного альбумина 125 в течение 48 часов, аналогично контрольным наноносителям IgG, которые не транспортируются.

Эти результаты исключают парацеллюлярный транспорт и согласуются с предыдущими данными, свидетельствующими о том, что наноносители с анти-ICAM используют опосредованный CAM эндоцитоз для трансцеллюлярного транспорта. При выполнении данной процедуры важно подобрать один или несколько подходящих типов клеток, а также проницаемый фильтр с соответствующим размером пор, диаметром материала и т. д. для модели Transwell, и методы маркировки для эффективного количественного определения системы доставки лекарственных средств после завершения процедуры. Для определения локализации транспортируемых материалов, а также для дополнительной проверки их состояния могут быть использованы другие методы, такие как флуоресцентная или просвечивающая электронная микроскопия.

Вестерн-блоттинг может быть использован для измерения деградации белков. EISA может применяться для определения способности транспортирующих носителей к таргетной доставке, а активность лекарственного груза может быть измерена с помощью спектрофотометрических анализов или других подходящих методов.