Высокое разрешение Всего горе В Ситу Гибридизация в Эмбрионы рыбок данио изучить экспрессию генов и функции

Общая цель этой процедуры заключается в оценке пространственно-временной экспрессии специфических генов, представляющих интерес, в эмбрионах данио-рерио. Это достигается путем создания зондов CD NA путем включения дигокислорода в связанные нуклеотиды с использованием транскрипции in vitro. Затем эмбрионы собираются на определенных стадиях развития.

Кориум удаляют, а эмбрионы хранят в метаноле при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Затем, после разложения и последующей фиксации, эмбрионы гибридизуются с помощью соответствующих зондов. Наконец, эмбрионы окрашивают геном антида и антителами, и сигнал вырабатывается с помощью субстратов для щелочной фосфатазы.

В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие распределение экспрессии генов в тканях на данной стадии развития посредством гибридизации in situ и визуализации. Хотя этот метод может дать гораздо более глубокое понимание нормальной экспрессии гена-мишени, он также может быть применен к другим состояниям, таким как экспрессия гена-мишени в модели заболевания, а также когда другие гены чрезмерно или недостаточно экспрессируются. Использование технологии микроинъекции Используя CDNA для интересующего гена, настройте реакцию мечения РНК для синтеза дигокислорода в зондах меченых РНК в свободной реакционной пробирке РНК путем добавления от одного до пяти микрограммов очищенной матричной ДНК в стерильную свободную РНК, обработанную дважды дистиллированной водой объемом до 13 микролитров.

Охладите реакцию на льду и добавьте следующие реагенты после осторожного перемешивания центрифуги 2000 об/мин в течение 30 секунд при комнатной температуре перед инкубацией реакции в течение двух часов при 37 градусах Цельсия после инкубации, удалите матричную ДНК, добавив два микролитра свободных РНК. ДНК одну инкубируют в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и останавливают реакцию добавлением двух микролитров 0,2 моляра ЭДТА, осаждение продуктов реакции путем добавления 2,5 микролитров четырех моляров хлорида лития и 75 микролитров 100% этанола. Смешайте раствор и выдерживайте при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 45 минут или в течение ночи.

Центрифугируйте суспензию в течение 30 минут при 13 000 об/мин и четырех градусах Цельсия. Затем промойте гранулу ледяным 70% этанолом после отжима в течение 10 минут. Просушите гранулу в течение двух минут перед ресусом, суспензив ее в 50 микролитрах нуклеазы, свободной двойной дистиллированной водой.

Затем выдержите его в течение 30 минут. При температуре 37 градусов Цельсия нанесите один-два микролитра зонда на 1%-ный гель в течение примерно 30 минут, чтобы убедиться в его качестве и целостности. Затем с помощью спектрофотометра можно количественно оценить зонд для регидратации ранее зафиксированных и замороженных эмбрионов.

Начните с изготовления корзинок, вырезав конические концы из микротрубок объемом 1,5 миллилитров. Затем снимите верхние обода с половины из них. Отрежьте небольшие кусочки нейлоновой сетки, чтобы покрыть концы, а затем в нескольких капюшонах нагрейте концы трубки на электрической горячей плите и вдавите их в сетку после того, как они остынут.

Удалите излишки нейлоновой сетки и храните корзины в 100% метаноле при комнатной температуре. После приготовления последовательного разведения метанола в PBS, согласно текстовому протоколу и добавления по четыре миллилитра каждого в лунки шестилуночной чашки, поместить эмбрионы в индивидуальные корзины для каждого зонда и инкубировать их в метаноле серии PBS в течение пяти минут на лунку, заканчивая тремя промывками в PBST. Закалывайте эмбрионы протеиназой К при комнатной температуре, используя следующее время инкубации для каждой стадии развития.

Затем зафиксируйте эмбрионы в 4%-ном параформном альдегиде в PBS на 20 минут и промойте их в PBST три раза по пять минут каждый. Далее приготовьте смесь для ацетилирования согласно текстовому протоколу и инкубируйте эмбрионы дважды по 10 минут каждый. Затем промойте эмбрионы и PBST дважды по 10 минут каждый.

Перенесите эмбрионы в стерильные микропробирки и инкубируйте с 200 микролитрами гибридизационной смеси или ТМ на водяной бане при температуре 70 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов. Добавьте в раствор от 100 до 200 нанограммов зонда и инкубируйте в течение ночи при температуре 70 градусов Цельсия на водяной бане. Замените раствор зонда предварительно нагретым HM и инкубируйте образцы при температуре 70 градусов Цельсия в течение 15 минут.

После введения образцов в серию H-M-S-S-C и блокирования эмбрионов в соответствии с текстовым протоколом, инкубируйте эмбрионы в разведении от одного до 5000 антител против D AP в блокирующем буфере в течение ночи при четырех градусах Цельсия с легким перемешиванием на следующий день. Промойте эмбрионы шесть раз по 15 минут каждый. После предварительного окрашивания эмбрионов инкубируйте их в BCIP и NBT.

Добавьте комнатную температуру в темноте на 30 минут. Используйте стереомикроскоп для мониторинга реакции окрашивания каждые 30 минут, чтобы остановить реакцию. Переложите корзинки с зародышами в лунки, содержащие стоп-раствор, два раза по 10 минут каждая, слегка перемешивая.

После фиксации эмбрионов 4%-ным параформальдегидом в PBS в течение 20 минут. Поместите эмбрионы, перенеся их в минимальном PBS в шесть луночных планшетов, содержащих 100% глицерин. Осторожно покачайте эмбрионы в темноте при комнатной температуре, на ночь сделайте изображение в 100% глицерине под стереомикроскопом.

Здесь показаны репрезентативные примеры окрашивания от situ до гибридизации. Фиолетовое окрашивание, наблюдаемое после гибридизации с рибозондом, представляет собой как распространенность, так и места экспрессии конкретного гена. Например, PC 5.1 демонстрирует очень дискретную экспрессию в передней и задней части глазного пузырька и примордиальной боковой линии через 24 часа после оплодотворения и сильно локализован в пределах нейромачт передней и задней боковой линии через 72 часа после оплодотворения.

В отличие от этого, PC 5.2 демонстрирует повсеместную экспрессию в ЦНС с отчетливой регионализацией в отическом везикуле somites и лежачем фрикальном протоке, а также высокую экспрессию в печени и кишечнике через 96 часов после оплодотворения. Отсутствие экспрессии генов при использовании соответствующих зондов Ribo служит отрицательным контролем, как показано на рисунке. Анализ экспрессии маркеров крови показал окрашивание SCL T one в двусторонних черепных клетках и в промежуточной клеточной массе или ICM.

Несмотря на то, что окрашивание для gata one также наблюдается в ICM, паттерн выражения отличается. Экспрессия F-L-K-K-D-R-L наблюдалась в основных и межсегментарных сосудах заднего мозга, а в ICM окрашивание для звукового ежа наблюдалось в ну-спинном мозге. В этих примерах экспрессия DLX two через 34 часа после оплодотворения локализуется в гипоталамусе Talon Cephalon и мезенхимальных дугах черепа, а экспрессия FK D seven Fox наблюдается в основном в нижней пластине и экспрессии HypoChlor.

Паттерны маркеров поджелудочной железы показали окрашивание инсулином в эндокринной поджелудочной железе и трипсином в экзокринной поджелудочной железе. Результаты, показывающие паттерны экспрессии с высоким разрешением, подтверждают успех описанного протокола для детектирования экспрессии генов как высокой, так и низкой распространенности. Вот несколько примеров из экспериментов, проведенных в некоторых оптимальных условиях.

Например, высокий фоновый сигнал с плохой экспрессией звука ежа является результатом недостаточной проницаемости и гибридизации при температуре от 55 до 60 градусов Цельсия. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять целую гибридизацию эмбрионов рыб данио с использованием зондов РНК, меченных канавами, окрашивание после гибридизации и визуализацию.