Культивирование носа человека эпителиальных клеток в Военно-воздушной жидкость

Общей целью этой процедуры является культивирование недифференцированных эпителиальных клеток носа на границе раздела воздушной жидкости. Это достигается путем предварительного получения поверхностных эпителиальных клеток носа от человека-добровольца. Второй шаг заключается в том, чтобы поместить клетки в планшеты для культивирования тканей, а затем развернуть клетки в колбах.

Затем расширенные клетки засеваются в трансвеллы и выращиваются до такой же беглости. Заключительным этапом является удаление апикальной среды для культивирования тканей сливающихся клеточных культур на трансвеллах для создания условий для культивирования воздушной жидкости. В конечном счете, клетки, выращенные на границе воздушной жидкости в течение трех-четырех недель, будут редифференцироваться в культуру мукоцилиарных эпителиальных клеток носа, имитируя фенотип носового эпителия in vivo.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими методами, такими как культивирование, бронхиальные эпителиальные клетки или получение коммерчески доступных респираторных эпителиальных клеток, является возможность исследователя установить априори популяцию, из которой можно взять образцы назальных эпителиальных клеток. Биопсия носа гораздо менее инвазивна, чем биопсия бронхиальной щетки во время бронхоскопии, поэтому популяции заболеваний с умеренным и тяжелым заболеванием могут быть взяты без каких-либо значительных побочных эффектов. Хотя важно помнить, что этот метод очень полезен для изучения влияния ингаляционных агентов на нормальный респираторный эпителий, также важно помнить, что каждый из этих образцов происходит из уникального генетического комплемента, и это делает их важными ресурсами для изучения генетических заболеваний, таких как муковисцидоз и первичная цилиарная дискинезия.

Демонстрировать процедуру будет Мисси Брайтон, техник из моей лаборатории. При подготовке к проведению биопсии носового соскоба субъект находится в вертикальном положении в кресле с прямой спинкой и запрокинутой назад головой, слегка поверхностные эпителиальные клетки, выстилающие носовые окончания, будут получены под прямым наблюдением через девятимиллиметровый многоразовый полипропиленовый назальный зеркало на операционном автоскопе с зеркалом. Это устройство обеспечивает оптимальную визуализацию носовых окончаний и гибкость движений.

Вставьте зеркало автоматического прицела в ноздрю и нижнее окончание визуализируется с помощью подсветки. Вставьте стерильную термопластичную кюретку через зеркало с наконечником, вытянутым дистально к задней части концевого клапана, слегка надавливая на нижнюю поверхность концевого клапана. Проведите кюреткой по поверхности слизистой оболочки пять раз, а затем втяните кюретку.

Успешное извлечение клеток слизистой оболочки, удерживаемых капиллярным действием, будет очевидно в чашке кюретки. Поместите кюретку с кюлетками в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую восемь миллилитров RPMI 1 6 4 0, и положите на лед для транспортировки в лабораторию. С помощью щипцов извлеките кюретку с кюретками, а затем с помощью пипетки P 1000 вытащите клетки из кюретки.

Выбросьте кюретку. Эпителиальные клетки носа, полученные с помощью соскоба из носа, впоследствии помещаются в 12-луночную пластину с чистым холодным кодированием. Начинать эту процедуру следует с минимального объема среды для роста эпителиальных клеток бронхов или BEGM плюс примерно от 80 до 100 микролитров на лунку в одну-четыре лунки покрытой пластины, в зависимости от размера биопсии.

Затем с помощью пипетки P 1000 осторожно удалите гранулу биопсийной ткани из пробирки, не отсасывая слишком много среды. Переложите гранулу в середину лунок, которые содержат среду. Храните биопсию вместе как кластер клеток.

Не разбивайте его. Сделать одноклеточную суспензию. Хорошая биопсия должна дать до четырех лунок, которые можно засеять.

Поместите тарелку в тканевый культурный инкубатор культуры. Клетки, расположенные в 12-луночном планшете, ежедневно контролируются до тех пор, пока они не достигнут 80-90% беглости CO, после чего они переносятся в колбы для расширения. Тщательно отсасывайте среду из каждой лунки, а затем добавьте 500 микролитров 25%-ного трипсина. Колодец.

Держите пластину при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока элементы не отсоединятся. Обычно это занимает две-три минуты для вытеснения клеток путем пипетирования вверх и вниз, а затем перенос отделенных клеток в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую ингибитор трипзина соевых бобов, или центрифугу SBTI для гранулирования после аспирации. Snatin Resus суспендирует в одном миллилитре, BEGM плюс среда и вихревая трубка расширяет клетки в колбе T 25 или T 75, в зависимости от размера гранул.

В этой демонстрации используется колба T 75. Добавьте в колбу пять миллилитров, BEGM плюс среды, а затем добавьте в колбу клеточную суспензию. Перенесите колбу в инкубатор для тканевых культур.

После размножения НЭК в колбах следующим шагом является посев клеток на вкладыши для тканевых культур. Извлеките носитель из колбы Т 75 и добавьте четыре миллилитра. Трипсин инкубирует клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех минут, пока клетки не отделятся.

Выбивайте ячейки, постукивая по колбе и пипетируя вверх и вниз. Переложите в 15-миллилитровую трубку, содержащую SBTI. Промойте колбу двумя миллилитрами.

Хэнка отбалансируйте солевым раствором и добавьте в 15 миллилитровую пробирку, центрифугируйте гранулы, а затем удалите наднатин. Тщательно подготовьте 12 лунок пластин. Решив, сколько пластин будет засеяно, пометьте пластины тем же кодом и номером, номером прохода и датой.

Добавьте 700 микролитров, BEGM плюс среды в базальную камеру каждого. Хорошо суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре, B-E-G-M-A-L-I. Среда путем вортексирования трубки.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, и я зацикливаю клеточную суспензию с B-E-G-M-A-L-I средой до общего объема, необходимого для количества пластин, которые должны быть засеяны. Добавьте 200 микролитров клеточной суспензии на апикальную сторону каждой непокрытой оболочки. 12-луночная вставка в ячейки.

Перенесите планшеты в инкубатор для тканевых культур для поддержания клеточных культур. Меняйте носители через день. Используйте среду B-E-G-M-A-L-I, 700 микролитров для базального компартмента и 200 микролитров для апикального компартмента.

Вставки должны оставаться погруженными до тех пор, пока ячейки полностью не сольются. Через два-шесть дней после посева на вставки для тканевых культур клетки должны быть полностью слиты без видимых отверстий в монослое для образования воздушной жидкости или LI через 48 часов после индукции ретиноевой кислотой. Удалите всю среду и добавьте 700 микролитров пневмококкальной, LI, поддерживающей среды только на базолатеральную сторону.

На апикальной стороне среда отсутствует. Сохраняйте клеточные культуры в течение четырех недель. Пожалуйста, обратитесь к сопроводительному тексту протокола для получения более подробной информации о процедуре создания и поддержания LI, человеческие НЭК, культивируемые в соответствии с протоколом, продемонстрированным в этом видео, редифференцируются в гетерогенный слой ECS, состоящий из реснитчатых и неоцененных клеток, представляющих ситуацию in vivo.

НЭК были зафиксированы в 4%-ной ФА и погружены в парафиновые НЭК. Культуры, окрашенные гематином и эозином, показаны на панели А. Некоторые из дифференцированных НЭК представляют собой бокаловидные клетки, продуцирующие слизь, идентифицированные синим цветом на панели В Яном Блю. На этом изображении гематина и эозина, окрашенного парафином, встроенного в культуру НЭК, показаны примеры неоптимальных недифференцированных НЭК с использованием другого протокола и составов среды.

В отличие от того, что наблюдалось на предыдущем рисунке, клетки здесь плоскоклеточные, а не кубовидные и не аффилированные, и не имитируют псевдо-стратифицированный респираторный эпителий. Ключевым моментом во всех этих процедурах является первый, и это получение действительно хорошего образца эпителия носа. Это приводит к развитию всей системы культивирования и развитию хорошего дифференцированного эпителия in vitro после этой процедуры.

Такие методы, как R-T-P-C-R, Вестерн-блоттинг, ИФА, а также многие другие клеточные и биохимические методы могут быть использованы для ответа на вопросы, связанные с реакциями, вызванными ингаляционными агентами или патогенами. Не каждая биопсия соскоба носа дает успешные посевы. Это будет зависеть от состояния субъекта, а также от состояния собранной ткани.