Decellularization Методология по производству природного Бесклеточная кишечника Matrix

Общей целью этой процедуры является создание естественного бесклеточного каркаса для инженерии кишечной ткани. Это достигается путем предварительного канюлирования верхней брыжеечной артерии крысы или СМА и забора тонкой кишки вместе с сосудистым доступом. На втором этапе внутрипросветный мусор вымывается, а внутрипросветные и сосудистые канюли подключаются к перистальтическому насосу.

Далее тонкая кишка перфузируется деионизированной водой в течение 24 часов при температуре четыре градуса Цельсия. На заключительном этапе тонкая кишка перфузируется дезоксивитамином натрия, оболочкой и ДНК при комнатной температуре. В конечном счете, полная децеллюляризация тонкой кишки, а также ее архитектуры и компонентов может быть визуализирована с помощью гистологии и электронной микроскопии соответственно.

В настоящее время мы столкнулись с клинической проблемой кишечной недостаточности, разрушительного состояния, которое поражает как детей, так и взрослых. Родительское питание и обычная трансплантация не обеспечивают полного излечения. Производство трехмерного васкуляризированного кишечного каркаса, как показано в следующем видео, распространяется и на терапию кишечной недостаточности.

Что примечательно в этом методе, так это то, что использование щадящих химикатов для цифровизации сохраняет микроархитектуру кишечника, о чем свидетельствуют результаты электронного микроскопа. Кроме того, поддержание иерархической сосудистой сети, следующей за цивилизацией, позволяет засеять структуру, которая может быть воссоединена с хозяином. Кровоснабжение Начните с установки перистальтического насоса с двумя трубками, затем пропустите 70% этанол через трубки перистальтического насоса в течение 15 минут с максимальной скоростью, а затем только что приготовленный PBS AA в течение еще 15 минут.

После промывки насос распылите и протрите брюшную полость усыпленной крысы весом от 250 до 350 грамм с 70% этанолом. Затем с помощью стерилизованных в автоклаве хирургических инструментов выполните лапаротомический разрез лобковой кости XO на брюшной полости, чтобы обеспечить чистое хирургическое поле, выпотрошите тонкую кишку справа от животного на бумажное полотенце, сбрызганное 70% этанолом. Следите за тем, чтобы постоянно смачивать кишечник P-B-S-A-A, чтобы избежать обезвоживания тканей и денатурации внеклеточного матрикса.

Затем найдите СМА, которая возникает под углом 90 градусов от аорты к кишечнику. Наложите шов вокруг СМА и подготовьте узел. С помощью канюли 27 калибра введите СМА из аорты, а затем быстро извлеките иглу, чтобы избежать разрыва стенки сосуда.

Теперь продвиньте пластиковую трубку канюли в SMA, закрепив трубку Викрилом пятью ох швами, а затем введите 10 миллилитров P-B-S-A-A для подтверждения канюляции. Затем с помощью ножниц надрежьте аорту проксимальнее и дистальнее СМА, чтобы освободить канюлю, чтобы избежать утечки кала при рассечении толстой кишки, наложите один шелковый узел на проксимальный конец илеоцекального перехода и один на дистальный конец сигмовидной кишки. Затем разрежьте терминальную подвздошную кишку и толстую кишку между двумя узлами и удалите толстую кишку.

Теперь разрежьте тонкую кишку в месте дуоденального соединения Юноны и освободите кишечник от любых соединительнотканных связей, которые он может иметь с брюшной полостью. Переложите тонкую кишку в чашку Петри, содержащую PBS aa. Затем с помощью пластиковой задней пипетки канюлировали проксимальный отдел кишечника, закрепив его на месте с помощью швов.

Наконец, разрежьте пипетку так, чтобы она подходила к замку приманки шприца объемом 60 миллилитров, а затем промойте просвет кишечника двумя полосками по 60 миллилитров P-B-S-A-A, чтобы удалить любые фекалии и мусор. Затем подсоедините трехсторонний стопорный кран к сосудистой канюле и поместите чашку Петри в контейнер для сбора любого переливающегося раствора. Затем начните подавать деионизированную воду через вальцовый насос с регулируемой скоростью master flex LS со скоростью 0,6 миллилитра в час.

Обращайтесь с тканью осторожно, чтобы убедиться, что пузырьки выходят из дистального конца. Как только все пузырьки будут удалены из канюль, перенесите аппарат в холодильную камеру. Затем начните процесс децеллюляризации, перфузируя просвет кишечника и сосудистое дерево проточной деионизированной водой в течение 24 часов со скоростью 0,6 миллилитра в час в течение первого часа.

Регулярно проверяйте устройство, чтобы убедиться в надежности всех соединений. Утечка минимальна, и в кишечнике нет пузырьков. Через 24 часа переместите аппарат децеллюляризации обратно к комнатной температуре.

Цвет кишечника должен был измениться на светло-розовый под вытяжкой. Взвесьте достаточное количество натриевого дезоксидного покрытия, чтобы сделать 4%-ный раствор в 300 миллилитрах деионизированной воды. С помощью вихря перемешайте раствор до прозрачного состояния.

Теперь замените деионизированный раствор дезоксиколлатом натрия. Проверьте подключения. Удалите любые пузырьки и перфузируйте тонкую кишку в дозе 0,6 миллилитра в час в течение четырех часов.

После этапа обработки дезоксисоли натрия ткань становится прозрачной. Поддержание сосудистой сетки также становится очевидным после добавления PBS AA в насос. Промойте кишечник PBS AA в течение 30 градусов, чтобы избежать любых взаимодействий между дезокси натрия, оболочкой и ДНК.

Затем перфузируйте ткань свежеприготовленными ДНК, одной при комнатной температуре со скоростью 0,6 миллилитра в час. Через три часа перенесите каркас в капюшон для культуры тканей и с помощью септической техники поменяйте пластину. Повторно простерилизуйте трубки перистальтического насоса, пропустив через нее этанол.

Промойте кишечник в последний раз с помощью P-B-S-A-A в течение 30 минут, чтобы убедиться, что все остатки растворов децеллюляризации удалены. Наконец, перенесите каркас в УФ-сшиватель и выполните два цикла стерилизации. Затем храните каркас в P-B-S-A-A.

Меняем раствор каждые три дня. При успешной децеллюляризации каркас должен иметь макроскопический вид, схожий с таковым у родного кишечника, но со светопрозрачными стенками. Сохранность макроархитектуры также должна быть очевидна по проходимости сосудистого дерева.

Когда краситель вводится через канюлю SMA, он должен равномерно распределиться по всему каркасу и достичь капиллярного дерева. Каркас должен быть свободен от ядерного и цитоплазматического материала, который можно было бы оценить. С помощью набора для количественного определения ДНК и простого гистологического анализа, окрашивание гематином и эоином должно продемонстрировать отсутствие ядерного и цитоплазматического материала при сохранении тонких слоев кишечника, как показано на этом изображении.

В частности, сохранение ворсинок и трещин на просветной стороне должно быть очевидным после сканирующей электронной микроскопии. Также следует ожидать дальнейшего сохранения компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, эластин и гликоамины-гликаны, как показано здесь. Например, окрашивание Massen Tri CHRO позволяет продемонстрировать неповрежденную соединительную ткань в каркасе.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создать естественный клеточный кишечный каркас.