Антитела Окрашивание в С. Элеганс Использование "Freeze-Крекинг"

Общая цель этой процедуры заключается в проведении окрашивания антителами на C. elegance. Для этого нематоды промывают, выкладывают на предметные стекла и тщательно сжимают между двумя клеевыми предметными стеклами, которые затем замораживают на сухом льду. Далее предметные стекла отделяются, чтобы вскрыть нематоды и сразу же помещаются в фиксатор.

Затем нематоды окрашивают с использованием стандартных методов окрашивания антителами Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии показывает успешное окрашивание антителами полуинтактных нематод. Основное преимущество этой методики перед существующими методами фиксации интактных нематод заключается в том, что она сводит к минимуму химическую обработку образца. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что подготовка слайдов и нематод довольно сложна для демонстрации.

Процедура будет проводиться мной мной и РТО Басу, аспирантом из моей лаборатории. Чтобы подготовить пластины с нематодами к окрашиванию, начните с помещения плоского куска металла на сухой лед, чтобы охладить его с помощью дистиллированной воды и стеклянной пипетки. Черви, выращенные на одной 60-миллиметровой пластине NGM с бактериями в 1,5-миллилитровую микропробирку. Черви могут быть синхронизированными или смешанного возраста, но избегайте использования планшетов с большим количеством брачного выкупа, которые трудно взломать или голодать червей, которые увеличат автофлуоресценцию с помощью той же стеклянной пипетки.

Промойте червей три-четыре раза дистиллированной водой, чтобы освободить их от бактерий. Затем собрать в основном взрослых особей, дайте им посидеть на лавочке три-пять минут. После того, как черви осядут на дно трубки, удалите большую часть воды из трубки, оставив примерно в два раза больше объема воды, чем у червей, но не менее 25 микролитров от общего объема.

Пометьте матовую сторону полилизиновых слайдов несмываемыми чернилами и поместите слайды на столешницу рядом с контейнером этикеткой для сухого льда вверх. Это будет служить нижней горкой. Имейте равное количество чистых обработанных не полилизином.

Доступны верхние слайды. Затем нанесите пипеткой около 25 микролитров червей в воде на нижнее адгезивное стекло и, используя боковую сторону наконечника пипетки, распределите червей по центру предметного стекла. Дайте им отстояться от 30 секунд до двух минут.

Концы червей будут прилипать при контакте с предметным стеклом. Самым сложным аспектом этой процедуры является предотвращение чрезмерного искажения червей, когда вы делаете следующие несколько шагов. Лучший способ сделать это — набраться терпения, иметь все наготове и не пить слишком много кофеина, чтобы ваши руки были красивыми и устойчивыми.

Держа нижнюю горку в одной руке, поместите верхнюю горку на нее так, чтобы все, кроме матовых частей, перекрывались. Жидкость должна удерживать предметные стекла немного друг от друга, чтобы черви все еще имели некоторую подвижность. Не позволяйте горке скользить одна над другой, что приведет к скручиванию червей.

Затем, используя большие и указательные пальцы каждой руки, осторожно нажмите прямо вниз на верхнюю горку. При правильном давлении несколько самых крупных гермафродитов разорвутся на краю слайда. В то время как большинство взрослых особей и личинок будут контактировать с каждой горкой, но останутся невредимыми сразу и осторожно, не позволяя горкам соскользнуть, положите их на кусок металла на сухом льду. В течение одной минуты предметные стекла будут казаться замороженными, но подержите их там в течение пяти минут, чтобы убедиться, что они полностью заморожены.

Теперь предметные стекла готовы к фиксации. Если вы не продолжите, немедленно храните предметные стекла в маркированной коробке при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение нескольких дней. Их следует использовать в течение недели или около того после их изготовления.

Не стоит использовать предметные стекла после длительного хранения. Отдельные нематоды также могут быть приготовлены на предметных стеклах способом, аналогичным показанному ранее. Положите плоский кусок металла на сухой лед, чтобы охладить его.

Затем с помощью червячной кирки перенесите отдельных нематод в каплю воды на пластине NGM, чтобы освободить их от бактерий. Нематод следует хорошо кормить для снижения аутофлуоресценции. Если возможно, повторяйте перенос в новые места воды по мере необходимости, пока червь не освободится от бактерий.

Далее подготовьте верхнюю и нижнюю горки, как и раньше. Затем капните от 5 до 10 микролитров воды на обработанный полилизином участок нижней горки, наблюдая за ней с помощью микроскопа. С помощью червячной кирки можно перенести до 20 червей в каплю воды.

Черви должны опуститься вниз, чтобы коснуться липкой поверхности предметного стекла. Затем поместите верхнюю горку, как и раньше, но не сжимайте, следя за тем, чтобы горки не соскользнули сразу. Поместите горки на металл на сухой лед.

Подержите на сухом льду от пяти до 30 минут и сразу приступайте к фиксации. Эти слайды нельзя сохранить для последующего использования. Чтобы слегка закрепить червей, начните с того, что поместите на лед красящие банки с растворами фиксации, чтобы охладить их в течение 10 минут.

Необходимыми растворами являются 100% метанол, 100% ацетон и фосфатно-солевой буфер. Возьмите пару нижних и верхних горок из сухого льда, быстро разверните их и сразу же погрузите нижнюю горку в ледяной метанол на две минуты, верхнюю горку выбросьте. Далее переведите предметные стекла из метанола в ледяной ацетон на четыре минуты.

Если на предметных стеклах было много червей, большая их часть отвалится в фиксаторе даже при хорошо подготовленных предметных стеклах. Если одиночные червячные стекла были правильно подготовлены, то черви должны оставаться прилипшими. Наконец, чтобы смыть фиксатор, опустите горки в банку с PBS.

Теперь предметные стекла готовы к окрашиванию, чтобы выполнить жесткое исправление с помощью формальдегида или глутаральдегида. Начните с разбавления раствора формальдегида или глутаральдегида реагента в PBS до конечной концентрации от 0,5 до 4%. Аликвоты можно хранить при температуре от минус 20 до минус 30 градусов и размораживать по мере необходимости. Помните, что формальдегид и глутаральдегид всегда очень токсичны, поэтому вам нужно носить перчатки и работать в вытяжном шкафу.

Возьмите пару нижних и верхних горок из сухого льда и быстро разверните их сразу. Поместите нижнее предметное стекло, на котором находятся червячки, в плоскую посуду с крышкой, с верхнего предметного стекла немедленно выбросьте пипеткой 200 микролитров фиксатора на центр области предметного стекла. С червями фиксатор частично замерзнет на месте, а затем расплавится, чтобы покрыть большую область предметного стекла.

Если черви не полностью покрыты фиксатором, немедленно и осторожно добавьте еще фиксатор с помощью микропипетки. Не допускайте, чтобы фиксатор стекал за край предметного стекла. Добавьте сложенные влажные салфетки без ворса в блюдо, чтобы оно оставалось влажным.

Не допускайте, чтобы салфетки касались горок. Затем накройте посуду крышкой и оставьте ее на 10 минут на ночь при комнатной температуре после завершения фиксации, с помощью пипетки аккуратно переложите фиксатор с рыхлыми червячками в пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем опустите предметное стекло в банку для окрашивания, содержащую PBS.

Вращайте трубку с червями на высокой скорости в течение 30 секунд, чтобы измельчить их. Дважды промойте червей PBS. Затем приступайте к окрашиванию их параллельно червячкам на предметном стекле.

Протокол окрашивания антителами аналогичен стандартным протоколам для любой ткани на предметных стеклах и подробно описан в сопроводительном документе. После окрашивания перенесите слайды в PBS и оставьте их там до 12 часов при четырех градусах Цельсия, пока они не будут готовы к монтажу. Чтобы установить слайды, снимите слайд с PBS.

Используйте безворсовую салфетку, чтобы высушить заднюю сторону, а затем быстро быстро положите ее на бумажное полотенце. Поместите около 20 микролитров монтажной среды на червей так, чтобы осталось примерно равное количество среды и PBS. На слайде.

Осторожно наклоните предметное стекло, чтобы смешать два раствора. Внимание: монтажная среда токсична. Придерживая матовый край.

Наклоните горку так, чтобы раствор собрался возле глазури. Затем поместите один край защитного стекла размером 24 на 60 мм на раствор, чтобы свести к минимуму образование пузырьков воздуха, которые увеличивают обесцвечивание и ухудшают обзор. Осторожно опустите крышку.

Если пузыри все же образуются, медленно приподнимите край крышки. Затем, не скользя по червям, снова опустите его. При необходимости добавьте больше PBS, чтобы устранить пузырьки воздуха.

С помощью безворсовой салфетки сожмите края чехла, проскользните и осторожно сдвиньте, чтобы края высохли. Край затвора должен быть виден по всему краю защитного стекла и не должен быть слишком влажным. Запечатайте крышку и нанесите два-три слоя лака на край.

Как только предметное стекло будет хорошо запечатано и высохнет, очистите защитное стекло и заднюю часть предметного стекла и поместите его в колодцы держателя предметного стекла. Герметичные предметные стекла можно хранить в течение нескольких дней при температуре четыре градуса Цельсия или недели при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение более длительных периодов времени. Пятнистые пятна ДНК и большинство зеленых красителей выцветают, при необходимости запечатывайте покровное стекло большим количеством лака для ногтей, особенно после использования любых масляных иммерсионных линз.

Следующие репрезентативные изображения были собраны с помощью слайдов, сделанных во время первых попыток окрашивания антител студентами лабораторного курса клеточной биологии. На этом изображении показан пример голов двух взрослых гермафродитов, которые должным образом сжаты, треснуты и слегка зафиксированы метанолацетоном. Они были помечены несколькими антителами и красителями.

При этом практически весь червь доступен для антител. При окрашивании здесь расположение ядер, на которое указывает окрашивание DPI, указывает на то, какие части червя не повреждены. Когда черви подвергаются воздействию более твердого фиксатора, такого как формальдегид, морфология червя может быть искажена.

На этих изображениях это можно увидеть в виде волнистого вида мышц, показанных красным цветом. Еще одной распространенной проблемой, связанной с использованием более жестких фиксаторов, является неравномерная фиксация или проникновение в определенные ткани. Это можно увидеть здесь, где мышца, показанная красным цветом, окрашена только в части червя.

Здесь наличие других окрашиваний, в том числе ДНК, показанных синим цветом, указывает на то, что по крайней мере часть тела присутствовала. Результирующий характер частичного окрашивания может быть легко идентифицирован практикой, так что можно определить все распределение окрашивания, даже если какой-либо отдельный червь демонстрирует неравномерное окрашивание. Распространенные проблемы, возникающие при замораживании трещин при использовании любых условий фиксации, проиллюстрированы здесь.

Наиболее распространенной проблемой является скручивание образца из-за относительного движения двух стекол. Во время компрессии здесь морфология окрашенных тканей указывает на то, что тело червя скручивается как раз сзади глотки. На этом изображении также показана проблема с окрашиванием фона из-за прилипания антител к полилизиновому покрытию предметного стекла.

Этого можно избежать, используя конфокальный микроскоп. Обратите внимание, что даже с практикой многие отдельные черви будут потеряны или продемонстрируют некоторые из показанных здесь проблем. После освоения подготовка и фиксация могут быть выполнены за час, а окрашивание - за день.

После этой процедуры могут быть выполнены различные методы фиксации с целью оптимизации окрашивания для любого данного антитела и ткани.